Wnt信號通路在骨肉瘤發(fā)生機(jī)制中作用的研究進(jìn)展

張熙 王東偉 劉爽

佳木斯大學(xué)（黑龍江佳木斯 154007）

骨肉瘤是起源于成骨間葉組織的原發(fā)性惡性骨腫瘤，約占小兒惡性腫瘤的5%。同時，骨肉瘤發(fā)病機(jī)制不明，預(yù)后較差，伴有較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移風(fēng)險［1］。因此，研究骨肉瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制對于預(yù)防、優(yōu)化臨床治療方案，提高患者生存率具有深遠(yuǎn)的意義。

近年來骨肉瘤細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制已有了較為深入的研究，原癌基因C-myc、erbB-2、SAS等，抑癌基因 Rb、p53、DCC、PTEN等，以及血管內(nèi)皮生長因子、環(huán)氧合酶-2等都已證實與骨肉瘤存在著密切關(guān)系。

一般認(rèn)為，骨肉瘤的發(fā)生是由于成骨細(xì)胞分化異常所致，而Wnt/β-Catenin在成骨細(xì)胞的增殖、分化以及遷移過程中扮演著重要角色，許多骨腫瘤中已發(fā)現(xiàn)Wnt/β-Catenin信號通路的異常激活。異常的Wnt/β-Catenin信號通過上調(diào)致癌基因（如c-Myc、CCND1、c-MET）引起骨肉瘤的發(fā)生［1］。越來越多的研究表明Wnt/β-Catenin信號分子與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展存在著密切關(guān)系，本文綜述了wnt信號分子在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的影響，望其成為治療骨肉瘤的突破口。

1 經(jīng)典Wnt信號通路

目前，Wnt信號通路分為β-catenin依賴型經(jīng)典Wnt信號通路和β-catenin非依賴型非經(jīng)典wnt信號通路。非經(jīng)典Wnt信號通路包括Wnt/Ca2+通路及Wnt/JNK通路。其中，經(jīng)典Wnt信號通路被認(rèn)為是最為關(guān)鍵且研究最多的Wnt信號通路。經(jīng)典Wnt信號通路是一種在進(jìn)化中高度保守的信號通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、極化、分化等方面發(fā)揮著重要作用。多篇文獻(xiàn)提出Wnt信號通路在骨骼惡性腫瘤以及腫瘤骨轉(zhuǎn)移灶中異常激活，如多發(fā)性骨髓瘤，尤文氏肉瘤，骨肉瘤，以及乳腺癌或前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤。

經(jīng)典Wnt信號通路作用機(jī)制是當(dāng)Wnt配體蛋白存在時，Wnt蛋白與受體一旦結(jié)合將磷酸化低密度脂蛋白關(guān)聯(lián)受 體 5/6（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP5/6），進(jìn)一步與卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)z）形成Fz-LRP5/6復(fù)合體。Fz蛋白作用于胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白（Dishevelled，Dsh），因Dsh和軸蛋白（Axin）都含有DIX結(jié)構(gòu)域，易聚合，故促進(jìn)了復(fù)合物（Wnt-Fz-LRP5/6）形成。LRP5/6因子的PPPSPXS區(qū)域磷酸化后與Axin結(jié)合，并且Axin、GSK3、CK1復(fù)合體形成又可促進(jìn)激活LRP5/6因子的PPPSPXS區(qū)域，進(jìn)一步導(dǎo)致Axin蛋白與LRP5/6的結(jié)合。與LRP5/6結(jié)合的Axin將不能與GSK-3/APC形成復(fù)合物，導(dǎo)致β-catenin不能被降解，沒有被降解的β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累、聚集并進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）結(jié)合形成復(fù)合體，β-catenin代替Croucho、Coop等抑制轉(zhuǎn)錄因子與TCF結(jié)合，從而激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞分化增殖。當(dāng)沒有wnt信號分子時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)累積的β-catenin與細(xì)胞膜上E-鈣粘蛋白（E-cadherin）結(jié)合，使之附著于細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白上，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間粘附，少部分的β-catenin通過泛素化途徑被降解，導(dǎo)致TCF/LEF與多種轉(zhuǎn)錄抑制蛋白結(jié)合而阻止靶基因的表達(dá)［2］。

Wnt通路通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活劑發(fā)揮作用，同時也受到分泌蛋白的調(diào)控，如wnt蛋白抑制因子（WIF-1）和分泌型卷曲蛋白（SFRP1）會抑制Wnt與Fz受體結(jié)合；Dickkopf相關(guān)蛋白 1（Dickkopf-related protein 1，Dkk1）能阻止 Wnt與LRP相互作用，從而抑制Wnt信號通路的激活［3］（圖1）。

2 經(jīng)典Wnt通路與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性

2.1Wnt配體蛋白與骨肉瘤的相關(guān)性Wnt蛋白是一類富含糖基化位點的自分泌或旁分泌糖蛋白，由wnt基因編碼作為Wnt通路的起始蛋白［4］。

Wnt蛋白在成骨細(xì)胞中對其增殖、分化和遷移起著調(diào)節(jié)作用，并且在小鼠模型中對骨愈合起著重要的成骨作用。目前，研究發(fā)現(xiàn)Wnt受體、Wnt配體蛋白以及wnt抑制蛋白分泌的減少與骨惡性腫瘤密切相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞株（U2OS，HOS，143B和Saos-2）中wnt1，wnt4，wnt5a，wnt7a，wnt14蛋白表達(dá)，wnt5a和wnt7a在4種細(xì)胞株中均有表達(dá)，wnt4和wnt1也在2種細(xì)胞株中表達(dá)［5］。HOANG等［6］發(fā)現(xiàn)wnt1蛋白在HOS和Saos-2骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)增高；而HOS，143B和Saos-2表達(dá)wnt4；U2OS，HOS，143B和Saos-2中wnt5a和wnt7a均有一定的表達(dá)；4種細(xì)胞株中均沒有檢測到wnt11的表達(dá)。

圖1 經(jīng)典Wnt信號通路Fig.1 Classic Wnt pathway

另外，在人骨肉瘤細(xì)胞系MG63和HOS中也發(fā)現(xiàn)了多種wnt配體蛋白的表達(dá)。有學(xué)者在兩種鼠骨肉瘤細(xì)胞系K7M2 和 K12 中 發(fā)現(xiàn) Wnt2，Wnt3，Wnt5a，Wnt6，Wnt7a，Wnt8a，Wnt10b，Wnt15配體蛋白表達(dá)。這些結(jié)果通過離體和臨床檢測都驗證了骨肉瘤的發(fā)生可能激活wnt相關(guān)蛋白。證明wnt配體蛋白通過自分泌或旁分泌的方式參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

MA等［10］用實時定量PCR研究比較了人骨肉瘤細(xì)胞（Saos-2）與人胚胎成骨細(xì)胞（hFOB）Wnt/β-Catenin信號通路組件的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Saos-2細(xì)胞的wnt3a、β-Catenin及LEF1較hFOB細(xì)胞高度上調(diào)［7］。基于這些研究，在骨肉瘤中多種wnt配體蛋白的過度表達(dá)表明wnt配體蛋白通過Wnt/β-Catenin信號通路及其下游相關(guān)基因使骨肉瘤發(fā)生，這為通過阻斷上游wnt相關(guān)蛋白抑制骨肉瘤的發(fā)生提供了新思路。

2.2Frizzled蛋白因子在骨肉瘤中的作用經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中wnt配體蛋白必須與膜上受體卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)z）結(jié)合才能發(fā)生級聯(lián)信號產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Frizzled蛋白作為wnt配體蛋白家族的主要受體，最初是從鼠骨肉瘤細(xì)胞系UMR-106中發(fā)現(xiàn)的，僅存在于動物細(xì)胞中［8］。Frizzled蛋白受體由細(xì)胞外N端保守的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域（CRD）、類似G蛋白偶聯(lián)受體的七次螺旋跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)C端的PDZ結(jié)構(gòu)域組成。低密度脂蛋白相關(guān)受體（LRP）是細(xì)胞表面分子，為經(jīng)典Wnt信號通路中識別wnt配體蛋白的共受體。當(dāng)Wnt信號激活時，Wnt配體蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled受體與跨膜分子LRP5/6形成復(fù)合體共同將細(xì)胞外的Wnt蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)［9］。

HOANG等［9］用RT-PCR在骨肉瘤細(xì)胞株（U2OS，HOS，143B和Saos-2）中研究wnt蛋白受體的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Frizzled1、Frizzled2、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled9和LRP5在這4種細(xì)胞株中均有表達(dá)，而Frizzled8在其中的3種細(xì)胞中有表達(dá)，F(xiàn)rizzled3只在143B細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn)在44例骨肉瘤患者中，50%的患者活檢切片有LRP5表達(dá)。提出LRP5在mRNA中的表達(dá)似乎與人類骨肉瘤的轉(zhuǎn)移潛能有明顯的聯(lián)系，可以作為骨肉瘤進(jìn)展的候選標(biāo)記［6］。在Saos-2中阻斷LRP-5信號通過E-cadherin/β-catenin通路抑制細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。用LRP5抑制劑阻斷Wnt信號后腫瘤進(jìn)程相關(guān)蛋白［鈣粘蛋白N（N-cadherin）、轉(zhuǎn)錄因子Snail、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）］下調(diào)，阻礙裸鼠體內(nèi)骨肉瘤生長和遷移，這些證據(jù)表明LRP5可能成為輔助骨肉瘤治療的靶點。

最近發(fā)現(xiàn)在不同年齡犬骨肉瘤細(xì)胞中Frizzled6的表達(dá)均明顯高于犬成骨細(xì)胞［10］，這使Frizzled6可能作為骨肉瘤細(xì)胞的標(biāo)志物。同時，骨肉瘤組織與其鄰近非腫瘤組織以及骨肉瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中Frizzled8的表達(dá)情況的比較中，發(fā)現(xiàn)Frizzled8在骨肉瘤中被高度上調(diào)［11］。這些研究都表明Frizzled作為經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的主要受體與骨惡性腫瘤（骨肉瘤）有密切的相關(guān)性。

2.3β-catenin蛋白因子在骨肉瘤中的作用β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中的核心蛋白，含有12個armadillo重復(fù)區(qū)的棒狀超螺旋結(jié)構(gòu)，可防止蛋白水解，在細(xì)胞的信號傳遞中有重要作用［12］。β-catenin主要位于細(xì)胞膜，少量游離在細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)Wnt信號通路未激活時，β-catenin通常被磷酸化，然后經(jīng)泛素酶途徑降解［2］。

β-catenin與骨惡性腫瘤的關(guān)系已經(jīng)得到了越來越多的關(guān)注，許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了骨肉瘤中β-catenin的聚集。在小鼠骨肉瘤細(xì)胞（LM8）和Dunn骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中同樣發(fā)現(xiàn)了β-catenin蛋白染色。LM8細(xì)胞具有高度的肺轉(zhuǎn)移潛能，而其β-catenin染色明顯高于原位癌Dunn細(xì)胞，這表明β-catenin是骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移潛在生物學(xué)標(biāo)志。值得注意的是，這兩組研究的基因序列分析都沒有檢測到β-catenin基因外顯子3片段上的突變，這表明骨肉瘤中β-catenin的積聚不是由于自身的突變造成，而可能是在Wnt通路的調(diào)節(jié)中發(fā)生的變化。

敲除β-catenin會提高甲氨蝶呤誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞死亡率，抑制β-catenin蛋白能夠增強(qiáng)甲氨蝶呤對Saos-2細(xì)胞的凋亡作用［7］。β-catenin作為經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中實現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵信號因子，其本身能與細(xì)胞膜上的E-cadhine結(jié)合影響細(xì)胞的粘附，許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤中異常表達(dá)，影響骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。這對于抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移性的研究具有較為深入的作用。

2.4細(xì)胞核內(nèi)因子LEF1對骨肉瘤的作用淋巴樣增強(qiáng)因子-1（LEF1）是 T 細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族成員之一，為高遷移率組分（HMG）轉(zhuǎn)錄因子。LEF-1蛋白主要有兩個功能結(jié)構(gòu)域，一是羧基端的DNA結(jié)合域，即HMG-Box；另一個是氨基端的β-catenin結(jié)合域。β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后與LEF-1的氨基端β-catenin結(jié)合域結(jié)合，LEF-1羧基端HMG-Box可以結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域，進(jìn)而激活下游靶基因（c-myc、cyclin D1、MMP-7等），導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。

LEF1與骨肉瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。有研究在Saos2細(xì)胞和人成骨細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)LEF1被上調(diào)［7］。另外，通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)LEF1在骨肉瘤組織中高表達(dá)，并用Western blot和RT-PCR檢測到與低增殖轉(zhuǎn)移能力的骨肉瘤細(xì)胞（F4）相比，高增殖轉(zhuǎn)移能力的骨肉瘤細(xì)胞（F5M2）中LEF1表達(dá)增高［13］，提示LEF1可能與骨肉瘤轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)。

2.5經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中其他因子與骨肉瘤的作用經(jīng)典Wnt/β-catenin通路也受到一些抑制因子的調(diào)控。Wnt抑制劑主要分為兩大類，其中包括通過競爭性結(jié)合wnt受體復(fù)合物的LRP5/6來抑制Wnt信號通路的DKK家族蛋白；以及直接與Wnt配體結(jié)合從而抑制Wnt信號通路的Wif-1、frizzled相關(guān)蛋白（sFRP）家族等［14］。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些Wnt信號通路抑制因子在骨肉瘤中具有抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的潛能。

DKK家族蛋白是一類與Wnt信號通路共受體LRP5/6結(jié)合，從而抑制經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的糖分泌蛋白。DKK3通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路而被作為腫瘤抑制因子。有研究顯示在骨肉瘤細(xì)胞中DKK3使β-catenin重新分配到細(xì)胞膜上，聚集在細(xì)胞膜上的β-catenin與E-cadherin結(jié)合形成復(fù)合體，阻止β-catenin的核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而抑制wnt信號通路下游TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子的激活，而E-cadherin與腫瘤侵襲密切相關(guān)。因此，DKK3可能降低骨肉瘤生長及轉(zhuǎn)移能力［15］。

Wif-1是一種Wnt配體拮抗劑，Wif-1的超甲基化在許多人類腫瘤中已經(jīng)被證實，例如鼻咽癌、肺癌、中皮瘤、乳腺癌和胃癌［16］。研究表明，在大多數(shù)骨肉瘤細(xì)胞和組織中Wif-1被下調(diào)，并且在小鼠骨肉瘤組織中重新表達(dá)Wif-1減少了腫瘤生長和肺部轉(zhuǎn)移能力［17］。體研究顯示，Wif-1是成骨細(xì)胞分化所必需的，而組織中Wif-1的減少和丟失會激活wnt信號通路，加速骨肉瘤的進(jìn)展［18］。還有許多因子能夠影響Wnt/β-catenin信號通路，進(jìn)而影響骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。研究已發(fā)現(xiàn)針對骨肉瘤的治療中其相關(guān)因子發(fā)生了改變，如sFRP家族一些蛋白等，這為骨肉瘤靶向治療提供了更多的研究基礎(chǔ)。

3 總結(jié)

Wnt/β-catenin信號通路在一些骨惡性疾病中扮演著重要的角色。在骨肉瘤中，許多Wnt/β-catenin信號通路中的蛋白過度表達(dá)，包括Wnt配體蛋白、Frizzled受體、LRP5/6、β-catenin以及一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF等。同時，基因編碼內(nèi)源性Wnt通路抑制劑，如：Wif-1、DDK3等的表觀遺傳沉默。這些現(xiàn)象都強(qiáng)調(diào)了異常Wnt信號在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中的重要影響。

雖然學(xué)者對Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤中的機(jī)制有所了解，但仍有許多具體調(diào)控機(jī)制待研究。例如：在骨肉瘤中，Wnt配體與其受體是如何相互作用的；哪些信號蛋白對骨肉瘤的發(fā)生和進(jìn)展發(fā)揮著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)以及識別作用。骨肉瘤的發(fā)展是一個極為復(fù)雜的過程，涉及多種分子信號通路，而Wnt/β-catenin信號通路也與其他多條信號通路，如Notch、TGF、MAPK通路中的信號因子存在crosstalking。這些復(fù)雜的信號通路是如何在骨肉瘤中相互交叉發(fā)揮作用的需要更多更全面的研究。因此，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤中的具體作用機(jī)制仍需更多深入的探索。