分子排阻色譜法測定肝素鈉注射液分子量與分子量分布的不確定度分析

肝素鈉是由豬或牛的腸黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬黏多糖類物質。肝素鈉注射液作為一種黏多糖硫酸酯類抗凝血藥物，常用于防治血栓形成或栓塞性疾病，如心肌梗死、血栓性靜脈炎、肺栓塞等。研究表明[1-3]，肝素鈉的抗凝血活性和抗栓活性及其結構以及分子量密切相關。《中華人民共和國藥典》二部中采用分子排阻色譜法（SEC）來測定肝素鈉及其注射液的分子量與分子量分布，作為質量控制的一個重要條件[4]。在實驗室評定時，根據(jù)中國合格評定國家認可委員會要求，出具結果的實驗室應能進行不確定度的評定程序，并對檢驗結果不確定度進行合理的評定，確保報告結果表達的準確性[5,6]。本研究以肝素鈉注射液為例，根據(jù)《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL06）[7]和國家計量技術規(guī)范《測量不確定度評定與表示》[8]，對分子排阻色譜法以肝素寬分布標準樣對照品測定肝素鈉中分子量與分子量分布的不確定度進行了測量和評定，考察其不確定度的主要來源，為實驗過程控制和評價檢定結果提供了合理的科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2414高效液相色譜儀（Waters中國有限公司，配示差折光檢測器），XSE205電子天平（梅特勒-托利多公司），Milli-Q超純水器（美國Millopore公司）。

肝素分子量對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：140819-201501）；肝素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號 140818-201501）；肝素鈉注射液（某廠家，批號160409）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 儀器操作條件 色譜柱：TSK預柱（6 mm×40 mm），TSK 4000SWxl（8 mm×300 mm，8 μm），TSK 3000SWxl（7.8 mm×300 mm，8 μm），三根串聯(lián)。流動相：0.1 mol/L醋酸銨溶液；流速：0.6 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μl；檢測器溫度：30 ℃；Empower PRO色譜工作站。

2.2 對照品溶液的制備 取肝素分子量對照品約25 mg，精密稱定，置5 ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為寬分布標準樣對照品溶液。另取肝素對照品約25 mg，精密稱定，置5 ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取肝素鈉注射液10支，混勻，精密量取2 ml，置5 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 ml，置5 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4 樣品的測定 采用分子排阻色譜法[9]分取寬分布標準樣對照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液20 μl進樣，同一供試品溶液20 μl重復進樣10次，采用Empower Pro工作站配置的GPC軟件處理數(shù)據(jù)，選用三階曲線擬合方程。

3 不確定度的評定

3.1 建立數(shù)學模型 分子排阻色譜法是根據(jù)待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術。本試驗根據(jù)不同分子量的肝素鈉在色譜柱上的洗脫時間（T）與重均分子量（Mw）的對數(shù)呈一定關系，用已知分子量分布的單一肝素分子量對照品（分子量基本從6000 Da至40 000 Da呈寬分布）制作標準曲線，然后將樣品用純水配制成與對照品相同濃度的進樣，由樣品的 T從曲線中求得樣品的 Mw。其原理可用公式表示如下：

式中：logMw為對照品Mw的對數(shù)，T為洗脫時間，B為校正曲線的截距，A為校正曲線的斜率。

3.2 測量不確定度的來源 由建立的測量數(shù)學模型可知，分子排阻色譜法中樣品濃度不影響測定結果，因此樣品制備過程的不確定度可忽略。校正曲線和測量精密度是其不確定度的主要來源[10,11]。

3.3 各不確定度分量的評定

3.3.1 測量精密度引入的不確定度 對于同一肝素注射液樣品進行10次平行測定，測定結果列于表1。

所測得的分子量平均值為：

樣本標準差為：

測量結果的標準不確定度為：

測量結果的相對標準不確定度為：

表1 同一樣品的重均分子量測定結果

3.3.2 校正曲線引入的不確定度 按 2.2方法中GPC軟件采用三階相關曲線擬合方式，將肝素寬分布分子量對照品各重均分子量的對數(shù)與對應洗脫時間的數(shù)據(jù)進行處理，得到相對分子量標準線性擬合的標準曲線為 logMw=12.2－0.645T+0.0189T2－0.000 21T3，r=0.999 998。表2列出了肝素分子量對照品寬分布標樣在各統(tǒng)計點的分子量和保留時間，以及通過三階擬合方程計算的數(shù)據(jù)結果。該曲線擬合是一種用連續(xù)曲線近似的描述平面上離散點組所表示的坐標之間的函數(shù)關系的數(shù)據(jù)處理方法[12]，因此，根據(jù)實際情況需要，先將非線性擬合的數(shù)據(jù)采用乘冪線性化法轉化為線性化數(shù)據(jù)[13]，由表 2的數(shù)據(jù)借助乘冪線性化回歸方程計算三階擬合曲線的標準偏差。轉化后的校正曲線公式如下：

式中：logMw為對照品Mw的對數(shù)；T0為洗脫時間T的k次乘冪（k=0.7）。

對樣品進行一次測定，測得的重均分子量Mw為16 027，其對數(shù)l0gMw為4.204 852，保留時間T為29.500 min，T0.7為 10.687 min。

根據(jù)貝塞爾公式計算標準曲線的剩余標準差為：

表2 肝素分子量對照品重均分子量及保留時間

式中：b為乘冪線性化回歸方程的斜率，b=0.3250；n為標準系列的點數(shù)，n=15；m為讀數(shù)次數(shù)，m=1；p為測量樣品次數(shù)，p=1；為標準系列個點保留時間T0.7的平均值，=10.434 min；xi為標準系列個點保留時間T0.7；為測試樣品濃度的平均值，=10.687 min。

所以，logMw=4.261 017±0.001 636；取反對數(shù)后，Mw的分布區(qū)間為18 171≤Mw≤18 309。因此，校正曲線的標準不確定度為 =18 309－18 171=138，相對不確定度：

3.4 合成相對標準不確定度、合成標準不確定度、擴展不確定度 綜合各分項不確定度分量的評定結果，最終得到測定肝素鈉注射液分子量的合成相對不確定度：

則合成標準不確定度：

3.5 擴展不確定度 取置信度 P=95%，包含因子k=2，則擴展不確定度：

3.6 實驗結果 通過對整個分析過程不確定度的分析以及樣品測定的結果，得出分子排阻色譜法測定肝素鈉注射液的分子量為：

4 結論

通過對分子排阻色譜法測定肝素鈉注射液分子量的不確定度進行評定，在評定過程中，由于不能直接根據(jù)GPC軟件處理實驗結果得到的標準曲線三階擬合方程建立模型，來進行不確定度評估，因此借助乘冪線性化方法將GPC軟件統(tǒng)計處理的標準曲線三階擬合方程轉化為最小二乘階方程。轉化后的方程不但能準確保留原三階連續(xù)曲線所表示的坐標之間的關系，更能根據(jù)簡化后的方程建立數(shù)學模型，從而進行實驗的不確定度評定。

根據(jù)實驗模型和試驗分析發(fā)現(xiàn)，試驗過程中影響不確定度分子量主要來源于測量精密度和標準曲線，與樣品的濃度無關，因此，在試驗過程中，供試品溶液及對照品溶液的濃度無特殊要求，也無需考慮稀釋步驟所引入的不確定度因素；而且試驗中，通過對照品溶液分子量的分布和保留時間計算得到校正曲線，此因素對不確定度的貢獻較大，這一因素與對照品自身的結構、分子量的分布情況有關。肝素對照品是一種分子量寬分布的對照品，配制成的對照品溶液只需要一份，其中肝素的分子量呈6000 Da～40 000 Da的寬分布結果；而一般分子排阻色譜法多采用窄分布標準樣，每個標準樣品只有一個分子量，需要配制幾個大小不同的分子量標準樣品來繪制標準曲線。因此，在試驗過程中，要想獲得較小不確定度的測量結果，對照品的選擇尤為重要，要選擇合適的、結構與待測物一致的對照品，才能保證測定結果的準確度。