疑似A型豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒致腫瘤病例

孫偉峰,王 貞,梁靜泊,劉海坤,馬譽蕓,蓋新娜,郭 鑫

（中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)部動物流行病學重點實驗室,北京 海淀 100193）

2018年1月,河北某豬場57日齡左右仔豬群出現(xiàn)批量死亡,個別表現(xiàn)神經(jīng)癥狀。豬場曾進行過豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、口蹄疫病毒及沙門菌的常規(guī)疫苗免疫。在病死仔豬剖檢過程中,發(fā)現(xiàn)1頭仔豬的胸、腹腔內(nèi),尤其是腎臟、脊柱兩側(cè),布滿了大量、大小不等的白色腫瘤結(jié)節(jié)。該仔豬肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)中PRRSV、CSFV、PRV等病原的核酸檢測結(jié)果均為陰性。我們對該病例進行了進一步的病原檢測,現(xiàn)報告如下。

1 大體剖檢病變

死亡仔豬外觀未發(fā)現(xiàn)皮膚出血、發(fā)紺等病理現(xiàn)象。剖開仔豬胸、腹腔后可觀察到其肺門淋巴結(jié)上布滿灰白色的結(jié)節(jié)狀突起;沿脊柱兩側(cè)腫瘤數(shù)量較多,分布集中（見中插彩版圖1B中黑色箭頭所示）;整個腎臟表面布滿突出表面的白色腫瘤結(jié)節(jié)（見中插彩版圖1A）。

2 病理切片觀察

將病變的腎臟組織制成病理切片（見中插彩版圖2）。在低倍鏡下可見,病變腎臟的基本結(jié)構已破壞,部分腎小管已壞死崩解（見中插彩版圖2B中黑色箭頭所示）,大量腫瘤細胞沿腎小管間隙呈浸潤式生長（見中插彩版圖2A中黑色箭頭所示）;部分區(qū)域腫瘤細胞已完全取代正常腎組織（見中插彩版圖2A中白色箭頭所示）。腎小管上皮細胞重度水泡變性（見中插彩版圖2C中黑色箭頭所示）,腫瘤細胞為大、中、小淋巴細胞,形態(tài)多樣,核分裂相多見（見中插彩版圖2D中黑色箭頭所示）。

3 病原檢測

取腫瘤組織進行研磨,提取總RNA,去除gDNA后進行反轉(zhuǎn)錄。用特異性引物進行PCR擴增（上游引物:5′-ATGCATCCCACGTTAAGCTGGC-3′,下游引物:5′-CTAGAGGTCAGTTTCTCCTTGGCTC-3′, 擴 增片段長度約2 kb）。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增條帶大小相符后（見中插彩版圖3）,切膠回收目的條帶,連接到p-EASY-blunt載體上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Trans-10感受態(tài)細胞,挑選陽性克隆進行序列測定。

序列比對結(jié)果顯示,擴增得到的序列與A型豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒囊膜（PERV-A-env）基因序列的同源性達99%。

綜合病豬的大體病變情況、腎臟組織病理學變化及病原核酸檢測結(jié)果,判斷該病例疑似為由PERV-A感染引起的淋巴肉瘤。

圖3 env基因的PCR擴增

4 討論

PERV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科γ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬,為哺乳動物類C型逆轉(zhuǎn)錄病毒,與貓白血病毒（Feline leukemia virus,FeLV）等同源性很高[1-2]。其基因組包括核心蛋白基因（pol）、多聚酶基因（gag）和囊膜基因（env）以及位于兩端的長末端重復序列（Long terminal repeat,LTR）,根據(jù)env基因的差異和體外細胞嗜性可將該病毒進一步分為 PERV-A、PERV-B和 PERV-C三個亞型[3]。

PCR檢測證實,中國小型豬基因組內(nèi)普遍含有PERV前病毒基因,陽性率達100%,且普遍存在兩種以上亞型同時存在的現(xiàn)象。RT-PCR檢測證實,大部分實驗豬體內(nèi)均存在PERV-A和PERV-B,但尚未檢測到PERV-C復制的豬群[4]。有學者對大白豬不同器官中PERV的3種結(jié)構基因進行半定量RT-PCR檢測,結(jié)果顯示,病毒基因在腎臟和肝臟中的拷貝數(shù)最多[5]。豬被認為是人體器官移植的最佳供體,但其基因組內(nèi)攜帶的PERV前病毒基因在體外可感染HEK-293等多種人類細胞[6]。Lj等將健康成年豬的胰腺移植到裸鼠體內(nèi)后可在裸鼠的多個臟器內(nèi)檢測到PERV感染,證實PERV可經(jīng)器官移植傳播并導致受體動物發(fā)病[7]。PERV也因此引起了研究人員的重視。

由于誘發(fā)腫瘤的因素非常復雜,病程較長,該病在臨床中難以發(fā)現(xiàn),多見于屠宰場。PERV感染細胞后,單鏈RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的指導下合成雙鏈DNA中間體并整合到宿主細胞基因組內(nèi),隨宿主細胞染色體復制而復制,并可通過精液垂直傳播[8-9]。雖然刺激整合到宿主基因組內(nèi)的前病毒基因產(chǎn)生感染性病毒粒子的因素尚未完全清楚,但該病的發(fā)生與豬的品種、個體差異及飼養(yǎng)管理水平差等因素有一定的關聯(lián)。

為監(jiān)控及預防腫瘤的發(fā)生,養(yǎng)殖場應該加強飼養(yǎng)管理,提供充足的營養(yǎng)并飼喂不含致癌物質(zhì)的飼料,以強化機體的免疫系統(tǒng),增強抵抗疾病的能力;同時,做好診斷工作,當發(fā)現(xiàn)疑似PERV感染引發(fā)腫瘤的個體時應及時撲殺。未來,有望通過基因編輯技術去除豬基因組內(nèi)的前病毒基因,以防止病毒基因通過垂直傳播危害后代仔豬群。