江西省豬鏈球菌臨床分離株毒力基因檢測及藥物敏感性分析

洪家兵,陶 政,黃奕雯,王 萍,張學(xué)良

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西 南昌 330045;2.南昌市農(nóng)村綜合產(chǎn)權(quán)交易中心,江西 南昌 330038）

豬鏈球菌病是一種由豬鏈球菌引起的人獸共患傳染病,主要引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥及突然死亡。隨著中國規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬鏈球菌病的流行情況呈逐步上升趨勢,該病已成為中國養(yǎng)豬生產(chǎn)中的常見病和多發(fā)病,對中國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展有較大的威脅。豬鏈球菌是一種新出現(xiàn)的人獸共患病原菌,可通過被感染的豬或者受污染的生豬肉產(chǎn)品傳播給人。目前國內(nèi)有不少關(guān)于人感染豬鏈球菌病的報道[1-2],豬鏈球菌病具有很重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

雖然現(xiàn)在已有許多的豬鏈球菌疫苗被研究出來,且被廣泛的應(yīng)用到養(yǎng)豬過程中。但由于豬鏈球菌包含有35個血清型（1型～34型及1/2型）及相當(dāng)數(shù)量難以定型的菌株,而目前市場上的豬鏈球菌疫苗主要是針對致病性最強(qiáng)的2型豬鏈球菌,疫苗很難有效的幫助養(yǎng)殖戶預(yù)防豬鏈球菌病。故在養(yǎng)殖過程中養(yǎng)殖戶更傾向于采用抗生素來防治豬鏈

球菌病,但是伴隨著抗生素的大量使用,豬鏈球菌的耐藥形式也變得愈來愈嚴(yán)峻,這給豬鏈球菌病的防治帶來了巨大的威脅。目前國內(nèi)外已經(jīng)有不少關(guān)于豬鏈球菌的調(diào)查研究[3-5],江西省是養(yǎng)豬大省,江西地區(qū)此類報告罕見。本試驗采用K-B紙片法測定從2014-2016年江西地區(qū)不同規(guī)?；i場疑似豬鏈球菌病的病例分離的62株豬鏈球菌對16種抗菌藥物的敏感性,并采用PCR技術(shù)對豬鏈球菌毒力基因進(jìn)行檢測,以期為江西乃至全國豬鏈球菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 從2014-2016年江西各地區(qū)疑似豬鏈球菌病的病豬中分離得到的62株豬鏈球菌。

1.2 主要試劑及抗菌藥物藥敏試紙 2×Taq PCR Master Mix,購自南昌沃瑪科技有限公司;胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基、瓊脂粉,均購自南昌天沃科技有限公司;阿莫西林（AMX,10 μg/片）、鏈霉素（SM,10 μg/片）、青霉素（PEN,10 μg/片）、四環(huán)素（TET,30 μg/片）、克林霉素（CM,15 μg/片）、頭孢唑啉（CZ,30 μg/片）、頭孢噻肟（CTX,30 μg/片）、復(fù)方新諾明（SXT,25 μg/片）、慶大霉素（GEN,10 μg/片）、阿米卡星（AN,30 μg/片）、恩諾沙星（ENR,5 μg/片）、萬古霉素（VAN,30 μg/片）、紅霉素（ERY,15 μg/片）、強(qiáng)力霉素（DOX,30 μg/片）、環(huán)丙沙星（CIP,5 μg/片）、氟苯尼考（FFC,30 μg/片）,均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 毒力基因檢測 根據(jù)文獻(xiàn)中[6-7]已公布的豬鏈球菌毒力基因 gdh、mrp、fbps、orf2、epf、sly 的引物序列,委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成6對特異性引物,引物序列信息見表1。采用25 μL的反應(yīng)體系（2 ×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA 模板2 μL,滅菌雙蒸水加至25 μL）,PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性 40 s, 各毒力基因（gdh、mrp、fbps、orf2、epf、sly）分別退火 40 s、35 s、35 s、45 s、40 s、30 s（退火溫度見表 1）,分別于 72 ℃ 延伸 45 s、35 s、45 s、50 s、45 s、90 s,共35個循環(huán);72℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,將電泳后凝膠放置在凝膠成像系統(tǒng)中,拍照并保存。

表1 毒力基因檢測引物

1.3.2 藥物敏感性試驗 采用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的K-B紙片法測定阿莫西林（AMX）、鏈霉素（SM）、青霉素（PEN）等16種抗菌藥對分離菌的抑菌圈大小。并參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI）公布的標(biāo)準(zhǔn)（表2）,通過抑菌圈的大小來判斷藥物的敏感性。以敏感、中介、耐藥3種形式對抑菌圈大小進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因測定 通過PCR技術(shù)對62株豬鏈球菌的 6 種毒力基因 mrp、orf2、gdh、sly、fbps、epf進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,所有毒力基因均被檢出,谷氨酸脫氫酶gdh基因（62/100%）,溶菌酶釋放蛋白mrp基因（47/75.8%）,纖連結(jié)合蛋白 fbps基因（36/58.1%）,毒力相關(guān)序列 orf2基因（34/54.8%）,胞外蛋白因子epf基因（33/53.2%）,溶血素sly基因（14/22.3%）。毒力基因電泳圖見圖1～6。

2.2 藥敏試驗 用16種臨床常用抗菌藥物對分離得到的62株豬鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗,發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌江西株對其均有不同程度的耐藥,主要對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、強(qiáng)力霉素的耐藥率較高,其中對四環(huán)素耐藥率最高,達(dá)到了96.78%;對頭孢唑啉、頭孢噻肟、阿莫西林及萬古霉素敏感程度較高,分別達(dá)到了85.49%、87.10%、82.26%和79.03%（見表3）。

表2 豬鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

圖1 豬鏈球菌分離株mrp基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2 豬鏈球菌分離株fbps基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 豬鏈球菌分離株orf2基因擴(kuò)增結(jié)果

圖4 豬鏈球菌分離株epf基因擴(kuò)增結(jié)果

圖5 豬鏈球菌分離株sly基因擴(kuò)增結(jié)果

圖6 豬鏈球菌分離株gdh基因擴(kuò)增結(jié)果

本次試驗分離的62株豬鏈球菌多重耐藥情況（見表4、圖7）。1耐菌株有1株,占1.61%;2耐菌株有2株,占3.23%;3耐到15耐菌株有56株,占90.32%;16耐菌株有3株,占4.84%。耐藥情況主要集中在3耐到11耐之間,48.39%分離株為四環(huán)素-紅霉素-強(qiáng)力霉素-克林霉素耐藥。

3 討論

據(jù)當(dāng)前研究報道,豬鏈球菌的毒力因子主要包括:莢膜多糖（cps）、胞外蛋白因子（epf）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、谷氨酸脫氫酶（gdh）、纖連蛋白和纖連蛋白原結(jié)合蛋白（fbps）、溶血素（sly）、毒力相關(guān)序列orf2等。豬鏈球菌致病性強(qiáng)弱主要與毒力因子具有相關(guān)性,gdh和cps不僅能夠作為豬鏈球菌的種屬鑒定和血清分型,也是重要的毒力因子[8-10]。在強(qiáng)毒株中,mrp和epf的檢出率較高,但是在非致病豬鏈球菌中檢出率較低,所以把mrp和epf作為豬鏈球菌毒力強(qiáng)弱的一個參考標(biāo)準(zhǔn)[11-12]。曾巧英等[13]通過相關(guān)研究證明,mrp可以獨立作為2型豬鏈球菌的毒力基因。

表3 豬鏈球菌分離株對16種抗菌藥物的藥敏率 （%）

圖7 豬鏈球菌分離株多重耐藥情況

表4 豬鏈球菌分離株多重耐藥情況

了解江西地區(qū)豬鏈球菌分離株的毒力基因分布情況,對于江西地區(qū)豬鏈球菌病的防治具有重要意義。通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)江西地區(qū)致病性豬鏈球菌分離株中的毒力基因型具有多樣性,主要的毒力基因為:谷氨酸脫氫酶gdh基因（62/100%）、纖連結(jié)合蛋白fbps基因（36/58.1%）、毒力相關(guān)序列orf2基因（34/54.8%）、溶菌酶釋放蛋白mrp基因（47/75.8%）。本試驗結(jié)果與王紅寶等[14]報道的山西地區(qū),李小軍[15]報道的上海地區(qū)致病性豬鏈球菌的毒力基因分布情況相比存在較大的差異性,說明致病性豬鏈球菌毒力基因型具有一定的區(qū)域性,提示相關(guān)部門應(yīng)該加強(qiáng)對豬鏈球菌病的檢疫防疫,以免造成大規(guī)模的暴發(fā)。

在當(dāng)前的養(yǎng)殖過程中,抗生素被廣泛的應(yīng)用于治療豬鏈球菌病。本試驗選取16種抗菌藥物,對分離得到的62株豬鏈球菌進(jìn)行藥物敏感性試驗。結(jié)果表明,分離株對臨床使用的16種抗菌藥物均呈現(xiàn)不同程度的耐藥性,而且大多表現(xiàn)為多重耐藥,主要集中在3耐至11耐,表明江西地區(qū)豬鏈球菌耐藥性比較嚴(yán)重,主要以多重耐藥為主。整體上看,江西源致病性豬鏈球菌對如阿莫西林、頭孢類等的常用抗生素保持著良好的敏感性,但是耐藥率也比較高,均在10%以上,耐藥率高于金卉[16]對122株國內(nèi)豬鏈球菌所檢測的4%,證明豬鏈球菌對常用治療藥物的耐藥性正在不斷增強(qiáng);對萬古霉素敏感程度較高,但是由于此種抗生素毒副作用較大,臨床很少使用,一般作為其他藥物效果不佳或者無效時的備選用藥。青霉素過去作為治療鏈球菌病的常用藥物,本次試驗中多表現(xiàn)為低度耐藥,表明豬鏈球菌對青霉素耐藥性正在增強(qiáng),需要引起注意;本次試驗中豬鏈球菌對克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星的耐藥性最為嚴(yán)重,這與金卉對8株豬鏈球菌江西分離株耐藥性檢測結(jié)果相似;這些數(shù)據(jù)表明,豬鏈球菌國內(nèi)分離株對大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類等抗菌藥物的耐藥性比丹麥、瑞典、日本等國家分離得到的豬鏈球菌更加嚴(yán)重,表明國內(nèi)外豬鏈球菌的耐藥情況具有差異性[17-19]。伴隨著豬鏈球菌耐藥性的不斷增強(qiáng),對于其耐藥性的監(jiān)測也顯得尤為重要。本研究所采用的試驗方法、試驗材料和研究結(jié)果都具有一定的科學(xué)性,這為江西地區(qū)豬鏈球菌病的防治提供了理論依據(jù)。