蛋白體外結(jié)合實驗聯(lián)合質(zhì)譜分析鑒定Num1的互作蛋白

唐仙英，肖 瑤，海 力

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

為確保細(xì)胞的命運決定因子準(zhǔn)確地分配到每個子細(xì)胞，所有真核細(xì)胞均須正確定位有絲分裂紡錘體[1].細(xì)胞質(zhì)動力蛋白Dynein在各類細(xì)胞的紡錘體定位過程中起關(guān)鍵作用[2-4].在芽殖酵母的不對稱分裂過程中，為了能沿胞質(zhì)微管產(chǎn)生拉力移動紡錘體，Dynein在與微管相連的同時，需被錨定在細(xì)胞膜上.Dynein在細(xì)胞膜上的錨定依賴于Num1(Nuclear migration 1，核遷移1)[5-7]，Num1是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的參與紡錘體定位的唯一位于細(xì)胞膜上的因子.Num1蛋白大約313 kDa，由多個結(jié)構(gòu)域組成.其中，位于其C末端的PH結(jié)構(gòu)域通過與細(xì)胞膜上的磷酸肌醇PI(4,5)P2相互作用介導(dǎo)Num1與細(xì)胞膜結(jié)合[8,9]；而另一個位于其N末端含有兩段預(yù)測的Coiled-coil序列的結(jié)構(gòu)域則通過自我相互作用介導(dǎo)Num1在細(xì)胞膜上形成由14個分子組成的補丁狀復(fù)合物，因此被命名為Patch Assembly(PA)結(jié)構(gòu)域[10].此外，PA結(jié)構(gòu)域也介導(dǎo)Num1與Dynein的相互作用[10].

定位于細(xì)胞膜上的Num1復(fù)合物不具有運動性[8, 11]，除了在紡錘體定位中的作用，它還通過與線粒體膜上特定種類的脂類物質(zhì)結(jié)合而介導(dǎo)線粒體與細(xì)胞膜的連接，并由此調(diào)節(jié)線粒體的分裂[12，13].Lackner 等[10, 12]發(fā)現(xiàn)線粒體與細(xì)胞膜的連接是由Num1的PA結(jié)構(gòu)域尤其是其中預(yù)測的Coiled-coil序列所介導(dǎo)，但Num1在紡錘體定位與線粒體中的活性如何調(diào)節(jié)目前尚不清楚.本研究利用在BL21大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)純化的PA結(jié)構(gòu)域，通過Pull-down實驗分離酵母細(xì)胞中與PA結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步通過質(zhì)譜分析完成鑒定，旨在通過鑒定Num1的互作蛋白，為揭示Num1的作用途徑及機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

DH5α和BL21大腸桿菌細(xì)胞(北京鼎國昌盛)；蛋白酶抑制劑混合物(Protease Inhibitor Cocktail, Roche)，S蛋白瓊脂糖(S protein agarose slurry)、Bugbuster蛋白提取反應(yīng)液(Novagen)；氨芐青霉素、氯霉素、異丙基硫代半乳糖苷IPTG、苯甲基磺酰氟PMSF(BioSharp).

高速冷凍離心機(jī)(CR22G型, HITACHI)；微量冷凍離心機(jī)(FC5515R型, OHAUS)；高壓細(xì)胞破碎儀(BT40/TS2/AA型, Constant System Cell Disruptor)；凝膠成像分析儀(Universal Hood II型, BIO-RAD).

1.2 質(zhì)粒與酵母菌株

編碼Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z的質(zhì)粒pXT65(PCN: PreScission蛋白酶酶切位點，S: S-tag, TEV: TEV蛋白酶酶切位點，Z: IgG binding motif)用于表達(dá)PA結(jié)構(gòu)域與S-tag的融合蛋白，其構(gòu)建方法如下：編碼Num1 1-303 aa且在5′端含有一個NcoI限制性內(nèi)切酶位點，3′端含有一個NotI限制性內(nèi)切酶位點的DNA片段分別用正向引物5′-CCAGCCATGGCCTCCCACAACAACAGGCATAAAAAG-3′和反向引物5′-CCAGGCGGCCGCCAGATGTTACTGTAGTATCG-3′從酵母基因組DNA通過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段經(jīng)NcoI和NotI酶切后與同樣經(jīng)NcoI和NotI酶切的載體pBSG01[10]連接并經(jīng)測序確認(rèn)，產(chǎn)生pXT65.pXT66(PCN-S-TEV-Z)為空載體對照.酵母菌株YWL555[10].

基因型為MATαnum1Δ∷HIS3ura3-52lys2-801leu2-Δ1his3-Δ200trp1-Δ63.

1.3 大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)

質(zhì)粒制備或轉(zhuǎn)化用DH5α細(xì)胞，重組蛋白表達(dá)和制備用BL21細(xì)胞[14].DH5α細(xì)胞用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng).用于制備重組蛋白的BL21細(xì)胞按下述方式培養(yǎng)：保存于-80 ℃的BL21大腸桿菌細(xì)胞在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng).次日從LB平板上挑取細(xì)胞接種到含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng).第3 d將液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞稀釋至OD600=0.1，25 ℃培養(yǎng)3 h，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L，20 ℃培養(yǎng)16 h誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，離心收集細(xì)胞.

1.4 蛋白可溶性檢測

按1.2培養(yǎng)的BL21細(xì)胞經(jīng)離心收集后，按每0.01 g細(xì)胞加入50 μL Bugbuster蛋白提取反應(yīng)液，混勻，室溫下輕搖15 min，4 ℃ 16000 g 離心20 min；分別取上清和沉淀加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min.將上清和沉淀制備的蛋白樣品分別經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后用考馬斯亮蘭染色，比較目的蛋白在上清和沉淀中的分配比例.

1.5 Pull-down實驗

1.5.1 重組蛋白的制備

攜帶pXT65和pXT66的BL21大腸桿菌按1.3各收集5 g細(xì)胞.按照每克細(xì)胞1 mL的比例加入Bind/Wash buffer [150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5), 0.05% TritonX-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail]，用高壓細(xì)胞破碎儀(壓力207 MPa, 4 ℃)破碎細(xì)胞.破碎的細(xì)胞4 ℃下12000 g 離心10 min，收集上清，此為大腸桿菌細(xì)胞裂解液.取100 μL S protein agrose懸液，1000 g離心1 min，除去上清，用Bind/Wash buffer洗3次，每次1 mL.加入大腸桿菌細(xì)胞裂解液，4 ℃旋轉(zhuǎn)混合45 min，離心，除去上清.再用Bind/Wash buffer洗珠子3次，每次5 mL，洗過的珠子置于冰上.

1.5.2 酵母細(xì)胞裂解液的制備

離心收集YPD液體培養(yǎng)基中旺盛生長的對數(shù)期YWL555細(xì)胞，每個pull-down實驗需要5 g濕細(xì)胞. 按1 mL/g的比例加入酵母裂解緩沖液[30 mmol/L HEPES (pH 7.4), 50 mmol/L乙酸鉀, 2 mmol/L醋酸鎂, 0.2 mmol/L EGTA, 0.05% Triton X-100, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail (Roche)]，用高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞.破碎的細(xì)胞液10000 g離心5 min，上清即為酵母細(xì)胞裂解液.

1.5.3 Pull-down反應(yīng)

將1.5.2中制備的酵母細(xì)胞裂解液加入到1.5.1中已結(jié)合了重組蛋白的S蛋白瓊脂糖中，4 ℃旋轉(zhuǎn)2 h，1000 g離心1 min，移去上清.用Wash buffer [10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0), 150 mmol/L KCl, 10% Glycerol, 0.05% Triton X-100, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail (Roche)] 洗3次，每次8 mL，除去Wash buffer，加入100 μL 蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min，收集上清保存于-20℃.

1.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白鑒定

所有的蛋白質(zhì)樣品均用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測[15].其中Pull-down沉淀下來的酵母蛋白樣品10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，再用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，切下被PA結(jié)構(gòu)域融合蛋白沉淀下來的特異性蛋白條帶進(jìn)行鳥槍法(shotgun)LC-MS質(zhì)譜分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 PA結(jié)構(gòu)域重組蛋白的表達(dá)

PA結(jié)構(gòu)域是預(yù)測的Coiled-coil結(jié)構(gòu)，高度不可溶.比較了不同培養(yǎng)條件下Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z融合蛋白在BL21大腸桿菌中的表達(dá)(見圖1)，最后確定適宜的誘導(dǎo)條件為IPTG濃度0.5 mmol/L，20 ℃過夜培養(yǎng)，此時Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z存在于細(xì)胞裂解液上清的比例相對較高，圖1中虛線框?qū)?yīng)預(yù)期蛋白帶，箭頭指示為該蛋白在20 ℃條件下表達(dá)(圖1b)較37 ℃下表達(dá)(圖1a)時存在于裂解液上清中的比例高.

1,3,5,7)上清；2,4,6,8) 沉淀a) 37 ℃, IPTG 0.5 mmol/L; b) 20 ℃, IPTG 0.5 mmol/L圖1 不同條件下蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig.1 Protein expression induced under different conditions

2.2 PA結(jié)構(gòu)域重組蛋白的純化

攜帶pXT65[Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z]或pXT66(PCN-S-TEV-Z)的BL21大腸桿菌細(xì)胞在含0.5 mmol/L IPTG濃度的培養(yǎng)基中20 ℃過夜培養(yǎng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá).由于誘導(dǎo)表達(dá)的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白含有一個S-tag，因此可在裂解大腸桿菌細(xì)胞后，使其與S蛋白瓊脂糖珠子結(jié)合而得到純化，結(jié)果見圖2.如圖2所示：S蛋白瓊脂糖能從表達(dá)pXT65的大腸桿菌細(xì)胞裂解液中沉淀下來Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白(箭頭所示)，而未從表達(dá)空載體pXT66的大腸桿菌細(xì)胞裂解液中沉淀下來蛋白.

圖2 Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白的純化Fig.2 Purification of Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z protein

2.3 PA結(jié)構(gòu)域重組蛋白與酵母蛋白的離體結(jié)合

為分離與PA結(jié)構(gòu)域相互作用的酵母蛋白，用結(jié)合在S蛋白瓊脂糖珠子上的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白與酵母細(xì)胞裂解液進(jìn)行了離體結(jié)合實驗，即Pull-down實驗.由于PA結(jié)構(gòu)域具有自我相互結(jié)合的特性[10]，為防止PA結(jié)構(gòu)域與酵母內(nèi)源的Num1蛋白相結(jié)合，酵母細(xì)胞裂解液從已敲除了野生型NUM1基因的酵母菌株(num1Δ，即YWL555)中制備.洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，即獲得了結(jié)合在S蛋白瓊脂糖珠子上的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z及與其結(jié)合的其他蛋白質(zhì)的復(fù)合物.此蛋白復(fù)合物樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后用考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果見圖3.如圖3所示：上箭頭為Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白，下箭頭是被Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z特異性沉淀下來的蛋白復(fù)合物(即pXT66的Pull-down樣品中缺乏的蛋白)，將其切割下來進(jìn)行質(zhì)譜分析，用于鑒定與PA結(jié)構(gòu)域互作的蛋白.

圖3 Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z的Pull-down蛋白檢測

Fig.3 Detection of proteins pulled down by Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z

2.4 互作蛋白的鑒定

通過對Pull-down沉淀下來的蛋白復(fù)合物進(jìn)行鳥槍法(shotgun)LC-MS質(zhì)譜分析，鑒定出一系列新的與Num1相互作用的蛋白，按照參與的細(xì)胞功能分組如表1.

3 結(jié)語

位于Num1 N末端的PA結(jié)構(gòu)域(1-303 aa)在Num1的功能中起核心作用，缺失了PA結(jié)構(gòu)域的Num1將同時失去其在紡錘體定位和線粒體中的功能[10,12,13].為分離Num1的互作蛋白，在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)了PA結(jié)構(gòu)域和純化標(biāo)簽的融合蛋白Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z，并用S protein agarose對其進(jìn)行了純化.結(jié)合在S protein agarose珠子上的重組蛋白用于從不表達(dá)內(nèi)源Num1蛋白的酵母細(xì)胞裂解液中沉淀PA結(jié)構(gòu)域的互作蛋白.通過對沉淀下來的蛋白進(jìn)行鳥槍法LC-MS質(zhì)譜分析，鑒定了一系列新的Num1的互作蛋白，包括大量的核糖體蛋白和參與蛋白折疊轉(zhuǎn)運的蛋白，參與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸酶和蛋白酶，及其他功能各異的蛋白質(zhì).這些結(jié)果為進(jìn)一步揭示Num1在紡錘體定位及線粒體中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為此過程的調(diào)控機(jī)制提供了更多思路.

表1 Num1的互作蛋白Tab.1 Proteins interacting with Num1