淺析微生物菌種保藏方法

劉巍 劉慶慶

摘 要： 微生物種系，是生物學(xué)研究的常用材料以及工業(yè)生產(chǎn)的重要原料，保持微生物種系的穩(wěn)定是保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)順利進(jìn)行的前提，因此微生物菌種的保藏是微生物研究的一項(xiàng)重要課題。

關(guān)鍵詞： 微生物；菌種保藏

0 引言

菌種保藏是微生物學(xué)檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)。其目的是在人工創(chuàng)造的條件下盡量減慢或停止菌種的生長繁殖，使其處于休眠狀態(tài)，減低菌種的變異率，在較長時(shí)期內(nèi)保持著生活能力，以便為擴(kuò)大微生物育種及微生物學(xué)研究提供大量可靠的優(yōu)質(zhì)菌種。菌種的妥善保藏是良好的實(shí)驗(yàn)室管理和實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的重要保證。標(biāo)準(zhǔn)菌種管理包括：標(biāo)準(zhǔn)菌種來源、菌種管理制度、標(biāo)準(zhǔn)菌種實(shí)驗(yàn)要求及注意事項(xiàng)?，F(xiàn)就微生物菌種保藏方法做如下探討。

1 微生物菌種保藏原理

各種微生物菌種保藏方法的主要原理是根據(jù)不同微生物的生理生化特點(diǎn)，人為創(chuàng)造缺氧、低溫或者干燥的條件，降低微生物的新陳代謝， 使其生命活動(dòng)基本處于停滯或者休眠狀態(tài)，停止生長繁殖的微生物，其遺傳物質(zhì)自然會(huì)更加穩(wěn)定。因此微生物的性狀在這種條件下保持穩(wěn)定，達(dá)到維持種系的目的。以下介紹的保存方法大致可以分為兩類：

（1）在基質(zhì)中低溫的保藏方法，包括斜面、半固體穿刺、石蠟、沙土管保藏法。這類保藏方法通過稍降低溫度輔以缺氧及減少養(yǎng)分供給等方式，以降低微生物的新陳代謝，從而達(dá)到較長時(shí)間保藏菌種的目的。

（2）在保護(hù)劑中超低溫保藏，也包括真空干燥凍存法。通過保護(hù)劑減少溶液結(jié)晶， 平衡微生物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，保證微生物的生存，同時(shí)把溫度降低到冰點(diǎn)以下使微生物的新陳代謝完全停止。這類方法雖然操作復(fù)雜，要求的硬件條件較高， 但可以實(shí)現(xiàn)很長時(shí)間保持菌種穩(wěn)定的目的。

2 微生物菌種的保藏方法

2. 1 定期移植法

亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（保藏厭氧細(xì)菌用）等。將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間進(jìn)行移植培養(yǎng)。保藏時(shí)間依微生物的種類不同而不同。此法操作簡單，但保存時(shí)間短，需要經(jīng)常移種，易于變異。只能作為菌種的短期保藏。

2. 2 液體石蠟保藏法

亦稱礦物油保藏法。選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，采用以下兩種方式進(jìn)行滅菌：（1）121 ℃濕熱滅菌30 min，置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。（2）160 ℃干熱滅菌2 h，冷卻后，經(jīng)無菌檢查后備用[2]。把液體石蠟注入已長好菌的斜面上并高出斜面頂端1 cm，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫（4～6℃） 干燥處或室溫下保存。保藏期間應(yīng)定期

檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充無菌的液體石蠟。

此方法簡便有效，保藏時(shí)間2～10年，可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。缺點(diǎn)是必須直立存放，占空間大，不便攜帶。某些以石蠟為碳源，或?qū)σ后w石蠟保藏敏感的菌株都不能用此法保藏。

2. 3 沙土管保藏法

取60～80 目河沙，用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，用10%鹽酸浸泡24h后棄鹽酸，用水洗至中性，將沙子烘干備用。取地面下40～60 cm 非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎后100 目過篩并用水洗至中性，烘干備用。將處理后的沙、土按質(zhì)量比2∶1 混合?；靹虻纳惩练盅b入安瓿管或小試管中，高度為1 cm 左右，塞好棉塞，121 ℃濕熱滅菌30 min，無菌檢驗(yàn)合格后方可使用。把制備好的菌懸液分裝每支沙土管0.5 mL，放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。塞好棉塞放入盛有干燥劑的容器中，用真空泵抽去水分。抽檢合格后封口，存放于低溫（4～6℃）干燥處保藏，每隔半年驗(yàn)證1 次。

本法方法簡便，設(shè)備簡單，適用于產(chǎn)孢子和有芽孢的菌種保藏，可保存兩年，但對營養(yǎng)細(xì)胞不適用。由于在真空干燥過程中，機(jī)械力容易造成孢子的死亡，因此在保藏放線菌和部分真菌的孢子時(shí)最好用干法接種。

2. 4 真空冷凍干燥保藏法

2. 4. 1 好氧菌冷凍干燥管的制備

安瓿管用2%鹽酸浸泡過夜，用自來水沖洗并用蒸餾水浸泡至pH 中性，烘干后加入脫脂棉塞，滅菌備用。保護(hù)劑可選擇血清、脫脂牛奶和海藻糖等。將培養(yǎng)好的菌體或孢子加入保護(hù)劑制成菌懸液，分裝于安瓿管中，每支0.2 mL。然后放入冰箱冷凍2 h 以上，達(dá)到-20～35℃左右。再置于冷凍干燥箱內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥直至其中水分被抽干，時(shí)間一般為8～20 h。將安瓿管在真空條件下熔封，低溫或常溫保藏。

2. 4. 2 厭氧菌冷凍干燥管的制備

主要程序與需氧菌操作相同，注意保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備，保護(hù)劑使用前應(yīng)在100 ℃的沸水中煮沸15 min 左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護(hù)劑中的溶解氧。

此法為菌種保藏方法中應(yīng)用最廣泛的，是國際菌種保藏機(jī)構(gòu)通常采用的方法之一，幾乎所有的微生物均可采用此法保藏。適用于菌種長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年[2]。方便之處在于因冷凍干燥管無需低溫保藏，所以運(yùn)輸方便，但此法所需設(shè)備要求高，操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴。

2. 5 冷凍保藏法

2. 5. 1 普通冷凍保藏技術(shù)（ - 20℃）

將培養(yǎng)好的固體或液體菌種用橡膠塞封口，置于普通冰箱中保藏。這一方法雖操作簡單但不適宜長期保藏。

2. 5. 2 超低溫冷凍保藏技術(shù)（ -60～- 80℃）

將生長至對數(shù)生長中后期的微生物細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基使其懸浮，然后加入等體積的20%甘油或10%二甲基亞砜作為冷凍保護(hù)劑，混勻后分裝入冷凍管或安瓿管中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5 年而活力不受影響。

2. 5. 3 液氮超低溫保藏法

主要程序與超低溫冷凍保藏技術(shù)（-60～-80℃）相同。需注意分裝好的安瓿管在放入液氮前需用控速冷凍機(jī)預(yù)凍，冷凍速率以1℃/min 為宜，冷凍到-35℃。如果無控速冷凍機(jī)，可將安瓿管置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。使用時(shí)從液氮罐中取出，立即放置38～40℃水浴中使其溶化，而后直接將其接種到適宜的培養(yǎng)基中即可。此法存活率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，保藏時(shí)間長，是長期保藏菌種的最好方法。適用于各種菌種的保藏，特別適用于難以用真空干燥保藏等方法保藏的菌種。此法需定期向液氮罐中補(bǔ)充液氮，以保證液氮罐中的溫度。

2. 6 基因工程菌的保藏

2. 6. 1 穿刺保藏法

在容量為2～3mL旋蓋玻璃小瓶中加入相當(dāng)于約2/3 容量的LB 瓊脂，滅菌后備用。用接種針挑取被保藏菌株單菌落，針刺至瓶底，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)過夜后避光保藏于4℃或室溫。穿刺法可保藏細(xì)菌2年之久。

2. 6. 2 甘油管冷凍保藏

在細(xì)菌培養(yǎng)物中加入適量甘油（使甘油終濃度為15%），分裝至保存管內(nèi)，置于-20 ℃或-70 ℃冰箱中保藏。此法可保藏1～10 年。

2. 7 固定化技術(shù)

固定化的保藏技術(shù)是將真菌菌株事先包裹在藻酸鈣中并進(jìn)行超低溫保藏的一種保藏技術(shù)。首先，制備真菌的孢子或菌絲的藻酸鹽的懸浮液，將懸液滴入藻酸鈣的溶液中，放置一段時(shí)間后，將菌絲或孢子的藻酸鈣小球轉(zhuǎn)移到高滲溶液中進(jìn)行脫水，然后按照菌種保藏的一些常規(guī)方法保藏， 如液氮超低溫保藏、油管保藏、蒸餾水保藏等。固定化的技術(shù)方法已用于真菌酶制劑、生防菌株、生物降解等多個(gè)方面的研究。

結(jié)語

由于微生物的多樣性，每種菌種保藏方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。根據(jù)菌種的生物學(xué)特性，科學(xué)的保藏菌種并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)菌種管理制度使用菌種，可以使實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)工作得到進(jìn)一步提升。

參考文獻(xiàn)

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