Lp-PLA2基因多態(tài)性與急性心肌梗死患者的易感性和臨床特征的相關(guān)性研究

苗常青，盧群，劉平，白玲，馬愛群

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病，CAD）分型中最嚴(yán)重的一種危急重癥，致死率較高，嚴(yán)重威脅人民生命健康，加重社會負(fù)擔(dān)。研究顯示，AMI的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)方面因素，包括遺傳因素、環(huán)境因素等[1]，動脈粥樣硬化易損斑塊引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和慢性炎癥反應(yīng)被公認(rèn)為是CAD重要的病理基礎(chǔ)[2]。針對AMI相關(guān)遺傳易感基因的研究，是目前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，對于高危易感人群早期篩查和及早干預(yù)，降低其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有重要的臨床價(jià)值。很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)炎性細(xì)胞因子存在單核苷酸多態(tài)性（SNPs），從而造成基因易感性不同，有可能是影響炎癥發(fā)生、動脈粥樣硬化（AS）及血栓形成等的重要因素，導(dǎo)致AMI的發(fā)生[3]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PLA2）屬于磷脂酶超家族成員之一，與血小板活化密切相關(guān)，被認(rèn)為是CAD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。國外有遺傳學(xué)研究證實(shí)Lp-PLA2主要受基因因素的調(diào)控，尤其是PLA2G7多個(gè)位點(diǎn)的基因突變會明顯影響Lp-PLA2的活性，影響CAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5]；但由于存在地域和種族差異，關(guān)于PLA2G7與CAD之間的關(guān)系一直存有爭議。通過采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-FRLP）的檢測方法，對在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的AMI患者及正常對照組人群的Lp-PLA2 rs1051931、rs1805017、rs16874954位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，以期發(fā)現(xiàn)AMI的遺傳危險(xiǎn)因素以及探討遺傳基因與AMI發(fā)病的相關(guān)性，為臨床治療提供科學(xué)理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象本項(xiàng)研究選取2017年1月～2018年2月于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科和急診科就診的176例AMI住院患者作為AMI組，年齡為37～83歲，平均年齡（58.46±11.72）歲，男性102例，女性74例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均行心電圖、冠狀動脈造影（CAG）、心肌酶譜檢查確診為AMI；②符合中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會關(guān)于AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：根據(jù)CAG證實(shí)至少1支冠狀動脈（冠脈）分支狹窄≥50%；③漢族，在本地居住20年以上者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)者；②合并心肌病、風(fēng)濕性心臟病、主動脈夾層等心臟疾病者；③合并家族性高膽固醇血癥、嚴(yán)重肝腎功能不全、自身免疫性疾病、腫瘤和急性或嚴(yán)重慢性感染性疾病者；④相互間有血緣關(guān)系者；⑤精神障礙不能合作者。另外選取同時(shí)期在我院健康體檢中心進(jìn)行體格檢查的健康受試者191例作為對照組，年齡為26～86歲，平均年齡為（57.30±13.29）歲，包括男性106例，女性85例。對照組受試對象均為漢族，本地居住20年以上。本項(xiàng)研究獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)以及受試者或家屬的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基線數(shù)據(jù)收集由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科醫(yī)護(hù)人員以現(xiàn)場調(diào)查的方式，發(fā)放調(diào)查問卷并當(dāng)場回收，以收集受試者的一般臨床資料，包括民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、居住地、飲食習(xí)慣、疾病和用藥史等。

1.2.2 標(biāo)本采集采集患者空腹肘靜脈血兩份各5 ml，一份置于EDTA抗凝管中，離心，取上清，置于-80℃保存?zhèn)溆?，用于DNA提??；一份用于檢測生化指標(biāo)。

1.2.3 血清DNA提取①取300 μl血液樣本置于1.5 ml EP管中，加入800 μl TBP緩沖液，混勻后，3000 rpm離心5 min，棄上清；②加入500 μl TBP緩沖液和10 μl蛋白酶K，置于55 ℃水浴鍋中孵育1 h；③振蕩15 s，充分混勻后，離心，取上清，加入260 μl無水乙醇，充分混勻；④將上述混合液置于含有DNeasy spin column柱的收集管中，離心，棄收集管中的液體；⑤將DNeasy spin column柱置于新的收集管中，加入500 μl AW1緩沖液，離心，棄收集管中的液體；重復(fù)該步驟一次；⑥將DNeasy spin column柱置于EP管中，加入200 μl AE緩沖液，離心，棄收集管中的液體；重復(fù)該步驟一次；⑦將提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，測定DNA濃度。

1.2.4 PCR-RFLP參照NCBI中Lp-PLA2位點(diǎn)信息使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物以包含目的位點(diǎn)，rs1805017位點(diǎn)（上游：5'-GAGCAGAGTAAAGA GAATAGTAA-3'；下游：5'-TGGGCTGAGGACT TAGCCTCTTTAAGCCTC-3'），rs16874954位點(diǎn)（上游：5'-CAAGTAACTGGGATTACAGGCACAT G-3'；下游：5'-CTTTACCTATATCATCCAGGTG-3'）；rs1051931（上游：5'-TCAAGATACCAAG CAAGAACAAGA-3'；下游：5'-GGATGTAAAGC AGCAAAATTGA-3'）。25 μl反應(yīng)體系：1.5 μl MgCl2+2.5 μl 10×緩沖液+2.5 μl dNTP +1 μl DNA模板+各2 μl上下游引物+0.5 U Taq DNA酶+適量ddH2O 95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收瓊脂糖凝膠靶條帶。采用ABI3730XL測序檢測分析。

1.3 觀察指標(biāo)采用Beckman AU5821全自動生化分析儀（Beckman coulter 公司，美國）檢測受試者入院24 h內(nèi)血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）等部分血脂指標(biāo)。血脂異常：TC＞5.72 mmol/L，TG＞1.70 mmol/L，HDL-C＜1.0 mmol/L，LDL-C＞3.64 mmol/L；或依靠服用降脂藥維持正常血脂水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本資料采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，各組間差異比較采用方差分析?；蛐突虻任换蛟诓煌纸M之間的分布比較采用卡方檢驗(yàn)，用單因素二元Logistic回歸分析，來分析影響AMI發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，篩選P＜0.05的變量，以這些因素為自變量，AMI發(fā)生為因變量進(jìn)行非條件多因素二元Logistic回歸分析。最后的結(jié)果用優(yōu)勢比（OR）及95%置信區(qū)間（CI）來表示。OR＞1表示該因素為危險(xiǎn)因素，OR＜1表示該因素為保護(hù)因素。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者一般臨床資料分析AMI組患者TC、TG、LDL-C水平明顯高于對照組，而HDL-C水平低于對照組，另外有糖尿病史者、高血壓史者的比例明顯高于對照組受試者（P＜0.05，表1）。

2.2 Hard-weinberg平衡檢驗(yàn)Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954、rs1051931位點(diǎn)在對照人群中的基因分型符合Hard-weinberg平衡規(guī)律（rs1805017：χ2＝0.120，P＝0.730；rs16874954：χ2＝1.11，P＝0.293；rs1051931：χ2＝2.79，P＝0.095），表明對照人群的基因型分布可反映整體人群基因的分布情況。

2.3 Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954、rs1051931位點(diǎn)SNP分析rs1805017位點(diǎn)位于Lp-PLA2基因的第4外顯子，含兩個(gè)等位基因：92R（野生型）和92H（變異型），從而形成3種基因型：純合子92RR、92HH和雜合子92RH。rs16874954位點(diǎn)位于Lp-PLA2基因的第9外顯子，含兩個(gè)等位基因：279V（野生型）和279F（變異型），從而形成3種基因型：純合子279VV、279FF和雜合子279VF。rs1051931位點(diǎn)位于Lp-PLA2基因的第11外顯子，含兩個(gè)等位基因：379A（野生型）和379V（變異型），從而形成3種基因型：純合子379AA、379VV和雜合子379AV。研究發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果都為單峰的是純合基因型，AMI組患者和對照組患者中Lp-PLA2基因rs1805017位點(diǎn)GG、GA、AA基因頻率和rs16874954位點(diǎn)CC、AC基因頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。而兩組受試對象rs1051931位點(diǎn)SNP組間比較無明顯差異（P＞0.05，表2）。

表1 兩組受試者一般臨床資料比較

2.4 AMI患者Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954位點(diǎn)SNP與血脂指標(biāo)的關(guān)系分析深入分析Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954 SNP與AMI患者血脂水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，rs1805017位點(diǎn)GA+AA基因型患者HDL-C水平明顯低于GG基因型患者（P＜0.05）；而rs16874954位點(diǎn)AC基因型患者TG水平明顯高于CC基因型患者（P＜0.05）；其余血脂水平在不同基因型患者之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表3）。

2.5 AMI易感性的單因素二元Logisitic回歸分析對AMI患者Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954、rs1051931位點(diǎn)分別進(jìn)行單因素二元Logisitic回歸分析，結(jié)果顯示，rs1805017、rs16874954位點(diǎn)SNP與AMI發(fā)病密切相關(guān)（P＜0.05，表4）。

2.6 AMI易感性的多因素二元Logisitic回歸分析在單因素分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行多因素Logistic分析，以AMI（無＝0，有＝1）作為因變量，篩選P＜0.05的因素作為自變量，結(jié)果顯示，rs1805017位點(diǎn)突變與AMI易感性密切相關(guān)，但是rs16874954位點(diǎn)SNP與AMI發(fā)病未見相關(guān)性，提示rs1805017位點(diǎn)多態(tài)性可能是AMI發(fā)病的獨(dú)立保護(hù)因素，而rs16874954位點(diǎn)突變可能與環(huán)境因素協(xié)調(diào)致病，同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)HDL-C是AMI發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表5）。

3 討論

目前大量研究已經(jīng)證實(shí)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)和遺傳因素都在AMI的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。動脈粥樣硬化易損斑塊破裂可引發(fā)血管內(nèi)膜損傷和炎性因子大量釋放，造成血管管腔狹窄或阻塞，引起心肌供血不足，嚴(yán)重者可致急性心肌梗死[7]。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的不斷進(jìn)展，人們對AMI的發(fā)病機(jī)理也有了更深的理解，許多研究表明，大量炎性細(xì)胞因子與心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[8]，因此，對炎性細(xì)胞因子及其基因多態(tài)性和AMI發(fā)病相關(guān)性的研究具有重要的臨床價(jià)值。

Lp-PLA2是由血管內(nèi)膜浸潤的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成并分泌的一種磷脂酶超家族成員之一，大部分與LDL-C結(jié)合，少部分與HDL-C結(jié)合，通過水解氧化磷脂生成溶血磷脂膽堿和氧化非酯化脂肪酸，誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9-11]。近幾年新研發(fā)的Lp-PLA2抑制劑darapladib，已經(jīng)被證實(shí)具有減少壞死的脂質(zhì)中心面積以及巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞數(shù)量，使血管內(nèi)易損斑塊趨于穩(wěn)定[12]，但目前關(guān)于darapladib的三期臨床研究結(jié)果并未顯示出明顯的改善主要觀察終點(diǎn)作用[13]。有遺傳學(xué)研究證實(shí)，Lp-PLA2的活性與基因因素密切相關(guān)，尤其是PLA2G7多個(gè)位點(diǎn)的基因突變會明顯影響Lp-PLA2的活性，從而影響CAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[14]；但關(guān)于PLA2G7與CAD之間的關(guān)系一直存有爭議。我們主要探討西安地區(qū)rs1805017、rs16874954、rs1051931這三個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性。

表2 Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954位點(diǎn)SNP分析（n，%）

表3 AMI患者Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954位點(diǎn)SNP與血脂水平相關(guān)性分析

表4 Lp-PLA2基因多態(tài)性位點(diǎn)與AMI易感性單因素分析

表5 Lp-PLA2基因多態(tài)性位點(diǎn)與AMI易感性多因素二元Logistic回歸分析

日本學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2基因rs16874954位點(diǎn)SNP是亞洲人群CAD發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，并認(rèn)為高加索人不具有此位點(diǎn)SNP[15]；Iona Y Millwood等[16]學(xué)者經(jīng)研究證實(shí)中國漢族人群V279F位點(diǎn)基因突變可顯著降低Lp-PLA2的活性，加大冠脈病變風(fēng)險(xiǎn)。杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心通過一項(xiàng)大型研究顯示，rs1805017、rs1051931位點(diǎn)的基因?qū)儆诜峭x突變，與CAD的發(fā)生有明顯的相關(guān)性，但是這兩個(gè)位點(diǎn)基因在CAD患者人群中的分布是降低的[17]。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，西安地區(qū)人群中rs1805017、rs16874954、rs1051931三個(gè)位點(diǎn)主要存在92RR、92HH和雜合子92RH基因型、純合子279VV和雜合子279VF基因型、純合子379AA、379VV和雜合子379AV基因型。AMI人群中rs1805017位點(diǎn)GG型以及rs16874954位點(diǎn)CC型基因頻率較健康對照人群明顯降低；而兩組受試人群rs1051931位點(diǎn)的基因型分布頻率未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。在此基礎(chǔ)上，筆者又進(jìn)一步分析了不同基因型AMI患者血脂水平的差異。rs1805017位點(diǎn)GA+AA基因型患者TG水平高于GG基因型患者，而HDL-C水平明顯低于GG基因型患者；rs16874954位點(diǎn)AC基因型患者TG水平明顯高于CC基因型患者；其余血脂水平在不同基因型患者之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這也說明了rs1805017、rs16874954位點(diǎn)的基因多態(tài)性影響AMI患者的血脂水平，提示這部分基因分型可作為高膽固醇血癥人群AMI發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測指標(biāo)。通過單因素分析，rs1805017、rs16874954位點(diǎn)SNP與AMI發(fā)病密切相關(guān)；調(diào)整患者血脂水平、糖尿病史、高血壓史等因素后，rs1805017位點(diǎn)SNP仍然與AMI易感性密切相關(guān)，但是rs16874954位點(diǎn)SNP與AMI發(fā)病未見相關(guān)性；提示rs1805017位點(diǎn)多態(tài)性可能是AMI發(fā)病的獨(dú)立保護(hù)因素，而rs16874954位點(diǎn)突變可能與環(huán)境因素協(xié)調(diào)致病。

綜上所述，本項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)西安地區(qū)人群Lp-PLA2基因rs1805017、rs16874954多態(tài)性位點(diǎn)與急性心肌梗死的發(fā)生有關(guān)，而rs1051931位點(diǎn)SNP與AMI的發(fā)生可能無直接相關(guān)性。雖然結(jié)果與國內(nèi)外部分研究結(jié)果不一致，據(jù)推測可能是由于樣本量偏少、存在種族和地區(qū)差異性等因素的影響，但是也從基因水平間接說明Lp-PLA2基因突變可能對AMI患者血脂水平有一定的影響，建議存在Lp-PLA2基因位點(diǎn)突變的人群注意控制血脂水平，以降低急性心肌梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。