楊樹組織培養(yǎng)研究綜述

丁依　鞏彥酉　歐品莉　楊巧琳　楊宗涵

摘 要：為擴大楊樹生產(chǎn)應(yīng)用，簡述了近年楊樹組培的研究現(xiàn)狀，重點對外植體類型，培養(yǎng)基的選取，激素的選擇及組培的分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽4個階段進行概述，以期對楊樹組織培養(yǎng)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：楊樹；組織培養(yǎng)；研究現(xiàn)狀；展望

中圖分類號： S792.11 文獻標識碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.11.022

Research Review on the Tissue Culture of Populus

DING Yi，GONG Yanyou，OU Pinli， YANG Qiaolin， YANG Zonghan

（College of Environment and Resource， Dalian Nationalities University， Dalian， Liaoning 116600，China）

Abstract： In order to expand the application of poplar production， the research status of poplar tissue culture in recent years was briefly described， focusing on the types of explants， the selection of culture medium， the selection of hormones and the four stages of differentiation culture， proliferation culture， rooting culture and seedling transplanting were summarized in order to provide reference for the research of poplar tissue culture.

Key words： Populus； tissue culture； research status； prospect

楊樹是楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus L.）落葉喬木植物的通稱，楊樹是世界上分布最廣、適應(yīng)性最強的樹種之一[1]，屬下通常分5個組：青楊組（Sect. Tacamahaca Spach）、白楊組（Sect. Lence Duby） 、黑楊組（Sect. Aigei-ros Duby） 、胡楊組（Sect. Turanga Bge）和大葉楊組（Sect. Leucoides Spach）[2]。楊樹具有無性繁殖容易、生長速度快、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點[3]，廣泛用于生態(tài)防護林、三北防護林和工農(nóng)業(yè)用材林。同時，楊樹樹干高大、整齊，常用作“四旁”綠化及道路綠化樹種[4]。隨著各個行業(yè)對木材需求量的日益加大，楊樹作為重要的木材樹種，逐漸體現(xiàn)出它的價值。但楊樹扦插繁殖具有成苗周期長、受季節(jié)的影響大和生長條件不易控制等缺點，在短時間內(nèi)難以繁殖出生長狀態(tài)統(tǒng)一的苗木。而組織培養(yǎng)作為一種快速繁殖技術(shù)，可有效地解決這些問題，短時間內(nèi)能繁殖大量優(yōu)良樹種。

1 楊樹組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀

隨著楊樹組培技術(shù)的日漸成熟，已經(jīng)有許多不同種類楊樹再生體系成功建立的例子，如2001楊[5]（Populus × euramericana cv.‘2001），大青楊[6]（Populus ussuriensis Kom.），725楊[7]（P. deltoides cl.‘725），箭桿楊[8]（Populus nigra L .Var. thevestina），巨霸楊[9]（Populus deltoides 50 × P. deltoides 36），南方四季楊[10]（Populus deltoides × P. nigra cv. Chile），歐美楊POR[11]（Populus × euramericana），歐美楊渤豐1號[12]（Populus ×euramericana cl.‘Bofeng 1），山新楊[13]（Populus davidiana × P. bolleana），小黑楊[14]（Populus simonii × Populus nigra）等都有報道。

2 楊樹組織培養(yǎng)概述

2.1 外植體的選擇

一般來說，外植體越幼嫩越容易再生植株[15]，在林木組培中首選腋芽萌發(fā)途徑，以腋芽萌發(fā)途徑進行組培，其再生植株的遺傳變異程度較愈傷組織誘導(dǎo)的小，但莖段腋芽組培的增殖率通常低于愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽的增殖率[16]。楊樹組織培養(yǎng)中大多選用葉片和莖段，少數(shù)用葉柄。姜洋等[6]以大青楊無菌苗葉片為外植體，14 d后產(chǎn)生不定芽，且不定芽翠綠，生芽率達100% 。李春利等[17]選擇毛白楊葉片為外植體，葉片通過直接分化培養(yǎng)的方式，20 d即可形成叢芽。李永麗等[5]選擇2001楊葉片、葉柄和莖段作為外植體進行研究，結(jié)果顯示，莖段、葉柄外植體7 d后兩端切口發(fā)紅膨大，開始形成綠色愈傷組織，15 d左右愈傷組織上開始出現(xiàn)不定芽，叢生芽誘導(dǎo)率較高，均達90%；葉片主葉脈切口處10 d后可見形成的白色愈傷，20 d后叢生芽出現(xiàn)，叢生芽誘導(dǎo)率為60%，但叢生芽量較莖段、葉柄外植體產(chǎn)生的多。從上述研究結(jié)果的誘導(dǎo)時間來看，莖段所需時間最短，葉片所需時間較長。所以，在楊樹組織培養(yǎng)中，與莖段和葉柄相比，葉片為較好的外植體材料。

2.2 外植體消毒

目前，對外植體消毒的消毒液常用的有乙醇、HgCl2、次氯酸鈉、次氯化鈣等[18]。對于大多數(shù)外植體只需要進行表面消毒即可，而有些外植體由于具有內(nèi)生菌，為達到較好的滅菌效果，除需要進行表面消毒外還需要進行其他處理[19]。葉片通常采用70%～75%乙醇處理10～30 s，0.1%的HgCl2處理3～7 min。莖段、莖尖和腋芽在消毒中通常選用乙醇消毒30～60 s，再用0.1%的HgCl2溶液處理5～15 min。在實際操作中，不同的外植體對消毒劑的敏感程度也不太相同，根據(jù)所選材料確定消毒劑及消毒時間。

2.3 培養(yǎng)基的選取與激素的選擇

2.3.1 培養(yǎng)基的選取 在植物組織培養(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基的選擇對植物組織的生長、脫分化、再分化有著很大的影響，對楊樹培養(yǎng)苗的生長至關(guān)重要。在楊樹組織培養(yǎng)的過程中，MS，1/2 MS，WPM等培養(yǎng)基都有廣泛的應(yīng)用，其中，應(yīng)用最多的是MS培養(yǎng)基及 1/2 MS 培養(yǎng)基，其營養(yǎng)豐富且全面。MS培養(yǎng)基具有較高的無機鹽濃度，對保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)和加速愈傷組織的生長十分有利，可用來誘導(dǎo)愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養(yǎng)。杜兆偉等[14]在小黑楊快繁與再生體系的優(yōu)化中，使用了MS，MH，WPM這3種培養(yǎng)基對小黑楊進行不定芽分化，結(jié)果表明，相同激素下的MS培養(yǎng)基 比MH效果要好，WPM效果最差，在多種激素處理下葉片都迅速褐化，只有少數(shù)莖段能進行分化。李永麗等[5]在2001楊組培再生體系建立的研究中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化效果比WPM好，且經(jīng)相同條件培養(yǎng)，MS培養(yǎng)基比WPM培養(yǎng)基外植體叢生芽誘導(dǎo)率高，在箭桿楊的初代培養(yǎng)及苗木生根培養(yǎng)中，1/2 MS培養(yǎng)基比MS效果更好，有利于愈傷組織再分化和不定芽的形成[8]，與歐美楊POR生根培養(yǎng)基選擇相同，不同楊樹的生長條件各不相同。所以，在選擇各個階段的培養(yǎng)基時，要根據(jù)實際情況而定。

2.3.2 激素的選擇 生長素類植物生長調(diào)節(jié)劑可顯著促進植物扦插生根，生產(chǎn)上最為常用的是IBA和NAA，能促進側(cè)根和不定根的形成，促進胚芽鞘和莖的生長，抑制根的生長[20-21]。細胞分裂素促進細胞質(zhì)分裂，從而使細胞體積擴大，最主要的是誘導(dǎo)芽的分化。人工合成的6-BA活性比其他細胞分裂素強，在農(nóng)業(yè)和園藝上得到廣泛應(yīng)用[21]，也是多數(shù)木本植物體誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)的主導(dǎo)激素[22]。在各類細胞分裂素中，6-BA 使用最為廣泛[23]，但單獨使用時增殖率較低，且無法促進試管苗的生長[24]。在楊樹的分化培養(yǎng)過程中，通常選用的細胞分裂素是6-BA，ZT，KT等，生長素為NAA[7，17]。對歐美楊渤豐1號的研究結(jié)果表明，渤豐1號楊葉片在6-BA 0.4 mg·L-1與NAA 0.04 mg·L-1組合的不定芽分化率和平均分化芽數(shù)均表現(xiàn)為最高，分別為100%和21個[12]，而甜楊葉片不定芽分化葉片在BA 0.5 mg·L-1與NAA 0.05 mg·L-1組合的培養(yǎng)基中獲得的誘導(dǎo)率最高，為98.8%，顯著高于其他培養(yǎng)基配方，平均不定芽數(shù)也較高[25]。TDZ作為一種有效的形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑在木本植物組織培養(yǎng)快繁體系中得到了廣泛的應(yīng)用[26]，周洲等[11]在對歐美楊POR組培再生系統(tǒng)研究中表明，TDZ在芽誘導(dǎo)過程中有顯著的促進作用，在TDZ，6-BA和NAA同時存在時，莖段和葉片均可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，而6-BA和NAA的組合也能誘導(dǎo)出叢生芽，但是誘導(dǎo)率較低，在TDZ 0.05 mg·L-1，6-BA 0.05 mg·L-1，NAA 0.05 mg·L-1的培養(yǎng)基上，15 d后叢生芽誘導(dǎo)率可達 97.3%。李春利等[17]在毛白楊葉片再繁和遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化中研究表明，6-BA和TDZ激素混合使用可促進葉片分化，葉片分化率可達 100%；增加芽伸長步驟提高了單片葉的繁殖系數(shù)。TDZ促進芽的分化要強于其他分裂素，但抑制芽的伸長，因此，增加芽伸長步驟來消除抑制。

2.4 分化培養(yǎng)

培養(yǎng)基中激素的種類及配比是影響外植體分化和不定芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素，不同部位的外植體的大小對楊樹組織培養(yǎng)的分化率及成活率存在影響。王金貴[27]篩選出的俄羅斯抗寒楊不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，6-BA與NAA的絕對質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1和0.2 mg·L-1。王顏波等[28]選出歐洲黑煙N46最適的分化培養(yǎng)基6 -BA與NAA的絕對質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1和0.03 mg·L-1。汪玲等[7]研究表明，725楊最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.3 mg·L-1+蔗糖 25g·L-1+瓊脂 6 g·L-1。沈迪玉等[29]選用四季楊莖段為外植體，研究表明，隨著6-BA濃度的增加，四季楊外植體的芽分化率呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢，當6-BA濃度為2.0 mg·L-1時外植體芽分化率最高。

2.5 增殖培養(yǎng)

將分化芽轉(zhuǎn)繼代到增殖培養(yǎng)基中，可以使分化芽成倍地增長，也可以降低細胞分裂素 6-BA 的濃度而利于分化芽下一步的生根培養(yǎng)[7]。外源激素的濃度及不同種類激素的相對配比對增殖存在影響，6-BA 單獨使用時增殖率較低，王大鵬等[30]在胡楊組織培養(yǎng)葉片及插穗毛狀根發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基組為MS+0.75 mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1 NAA+6.0 g·L-1瓊脂時，平均株高達到最大值（4.2 cm）， 不定芽數(shù)較多，且無玻璃化現(xiàn)象，葉色鮮綠，未見黃化現(xiàn)象，為最佳增殖培養(yǎng)基。畢海林等[31]在黃楊葉栒子組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究中顯示，增殖系數(shù)隨6-BA濃度的降低而降低，在一定范圍內(nèi)隨6-BA濃度的增高而增高，過高的6-BA濃度反而會使增殖系數(shù)降低。在相同濃度的細胞分裂素中，加入適量生長素 IBA，增值系數(shù)會略有升高；當6-BA質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1和IBA質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1時，黃楊葉栒子的增殖系數(shù)最高。因此，不同楊樹組培中激素及其濃度的選擇應(yīng)根據(jù)其具體情況來確定。

2.6 生根培養(yǎng)

一般影響組培苗生根的因素有植物材料、培養(yǎng)基類型、植物生長調(diào)節(jié)劑和其他因子。楊樹的生根培養(yǎng)大都用1/2 MS培養(yǎng)基，加入一定量的 NAA，IAA，IBA。姜洋等[6]在大青楊再生體系的優(yōu)化中指出，1/2 MS +0.1 mg·L-1 IBA 的生根最好，平均生根數(shù)最高。在生根培養(yǎng)中，適量的GA3有利于根的生長和壯苗，李永麗等[5]在2001楊組培再生體系建立中顯示，2001楊不定芽在1/2 MS+IAA 0.02 mg·L-1+IBA 0.22 mg·L-1+AC 3.00 g·L-1+蔗糖30.00 g·L-1培養(yǎng)基中生根最好，形成根系較多，生根率達90%。張瑞芝等[32]在歐美楊再生體系的建立中表明，NAA濃度會影響無根幼苗的生根率，蔗糖濃度過高會導(dǎo)致根較短或較長，且須根不明顯。選出的最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.25 mg·L-1 NAA+20 g·L-1蔗糖，有利于再生苗根生長，可提高存活率。

2.7 煉苗移栽

在楊樹組培苗煉苗移栽過程中，常使用草泥炭、蛭石、珍珠巖、腐質(zhì)土、沙、草木灰等作為栽培基質(zhì)。生根苗出瓶前2～3 d，打開瓶蓋讓瓶苗逐步適應(yīng)外界的光照和濕度，以增強組培苗對環(huán)境的適應(yīng)能力，可以提高組培苗移栽成活率[33]。在滇楊組培苗移栽中，沙∶腐質(zhì)土∶蛭石=1∶1∶1基質(zhì)中成活率最高，且疏松、透氣性好的基質(zhì)有利于組培苗成活和生長，復(fù)合基質(zhì)比單一基質(zhì)要好。王娜等[13]將胡楊移栽到蛭石∶珍珠巖為2∶1（V/V）的基質(zhì)中，將小苗栽植到裝有配制的營養(yǎng)土或腐殖質(zhì)土的育苗缽中，苗木也可在取出栽植前把老根去掉[34]?？梢?，不同植物對基質(zhì)的要求存在一定的差異，因此，在篩選煉苗基質(zhì)時，應(yīng)參考具體植物對土壤質(zhì)地的偏好來設(shè)計煉苗基質(zhì)。

3 存在問題及展望

以上是楊樹組織培養(yǎng)的幾個主要方面，利用組培技術(shù)在楊樹擴繁上獲得許多成果，但同其他植物組培一樣，存在著易受污染、玻璃化、褐化等現(xiàn)象，仍需進一步研究。組織培養(yǎng)技術(shù)為楊樹的基因工程提供了基礎(chǔ)，在短時間內(nèi)可以得到優(yōu)質(zhì)、大規(guī)模的優(yōu)良品種，為擴大楊樹生產(chǎn)應(yīng)用、推動社會經(jīng)濟發(fā)展作出更大貢獻。

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