NGF治療兔骨筋膜室綜合征神經損傷的作用研究

劉燚，張金龍，孫郁雨，崔志明

(南通市第一人民醫(yī)院骨科，江蘇 南通 226000)

隨著社會科技的發(fā)展和進步，交通、施工等變得越來越便利的同時，外傷事故的發(fā)生率也隨之增加。其中肢體損傷占很大的比例，而骨筋膜室綜合征則是其中比較嚴重的創(chuàng)傷疾病之一[1]。眾所周知，骨筋膜室綜合征一旦延誤治療，輕者肌肉神經損傷、功能受損，重者需要截肢，甚至死亡。因此，早期診斷、早期治療、早期康復已經成為治療骨筋膜室綜合征的共識。然而，目前大家的關注點多集中在早期手術切開減壓等治療方面，對神經損傷的早期治療和預防關注不多。本研究通過建立兔的骨筋膜室綜合征的動物模型，通過兔腿間隔筋膜室內壓力動態(tài)監(jiān)測，兔后腿神經標本的HE染色、免疫熒光等方法明確神經損傷的變化情況，并早期局部應用神經生長因子(nerve growth factor，NGF)進行干預，探求使用NGF早期預防和治療骨筋膜室綜合征神經損傷的時機和療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗于2016年9月至2017年12月在南通大學免疫實驗室北區(qū)動物實驗室完成。健康成年新西蘭兔24只，雌雄不限，體重(2.5±0.3)kg(由南通大學動物中心提供)，自由進食顆粒狀飼料及飲用自來水。實驗室環(huán)境溫度20～23℃，相對濕度55%～65%。試劑分別來自abcam、cell signaling等。

1.2 設計、實施、評估者 設計為全部作者，干預實施為第一作者和第二作者，評估為全部作者，均受過專業(yè)培訓，采用非盲法評估。

1.3 方法 動物模型制備：參照Aydin F等[2]使用的“止血帶”法建立兔骨筋膜室綜合征動物模型。模型制作前準備：實驗兔禁食12 h，禁飲4 h。麻醉藥物：烏拉坦(200 g/L)，使用劑量：5 mL/kg，注射方式：耳緣靜脈緩慢注射麻醉，注射速度：10 mL/15 min。操作前半小時予以兔后腿備皮，使用簡易監(jiān)測儀觀察實驗兔的基本生命體征。模型制作：止血帶加壓環(huán)扎實驗兔已備皮的后腿，在止血帶外再使用血壓器袖帶充氣加壓，固定8 h后松解止血帶，兔后腿出現(xiàn)明顯腫脹，骨筋膜室綜合征動物模型制作成功。

1.4 兔腿間隔筋膜室內壓力測定 使用Whiteside針刺裝置監(jiān)測小腿部骨筋膜室內壓。操作前需準備物品：普通汞柱血壓表、三通管、普通針頭、注射器、生理鹽水。具體操作：將血壓表與三通管、針頭、注射器連接完畢。將血壓表與實驗兔被測后腿放在同一平面。針頭刺入兔腿脛前筋膜間隙內(注意不要刺入肌肉中)，注射器抽取空氣通過三通管推入，同時注入少許生理鹽水(保證針頭在間隙內通暢而不被周圍組織所阻塞)，三通管連接血壓計后測量，即可顯示實驗兔腿的脛前筋膜室內壓。

1.5 Western blot 切除新鮮的組織標本，并進行組織蛋白的提取，之后采用SDS-PAGE凝膠電泳分離組織蛋白質，行轉膜印跡，待完全冷卻后，將轉印膜行麗春紅染色30 s，然后dd H2O脫色2 min。最后行蛋白質免疫檢測。掃描生物圖像處理系統(tǒng)測定灰度、分析圖像、量化灰度，然后進行分析，相同條件下重復3次實驗，以減小誤差。

1.6 HE染色分析

1.6.1 組織石蠟包埋切片 新鮮組織固定于4%多聚甲醛24 h以上。將組織從固定液取出，在通風櫥內用手術刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應的標簽放于脫水盒內。將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水。75%酒精4 h，85%酒精2 h，90%酒精2 h，95%酒精1 h，無水乙醇Ⅰ 30 min，無水乙醇Ⅱ 30 min，醇苯5～10 min，二甲苯Ⅰ 5～10 min，二甲苯Ⅱ 5～10 min，蠟Ⅰ 1 h，蠟Ⅱ 1 h，蠟Ⅲ 1 h。將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，蠟凝固之前將組織從脫水盒內取出，按照包埋面要求放入包埋框，并貼上對應的標簽。于-20℃凍臺冷卻，蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4μm。切片漂浮于攤片機40℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60℃烘箱內烤片。待水烤干、蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 HE染色 依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ 20 min，無水乙醇Ⅰ 10 min，無水乙醇Ⅱ 10 min，95%酒精5 min，90%酒精5 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸餾水洗。切片入Harris蘇木素染3～8 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min。將切片依次放入95%酒精Ⅰ 5 min，95%酒精Ⅱ 5 min，無水乙醇Ⅰ 5 min，無水乙醇Ⅱ 5 min，二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.7 免疫熒光實驗

1.7.1 冰凍切片制片 新鮮組織固定于4%多聚甲醛24 h以上。將組織從固定液取出，在通風櫥內用手術刀將目的部位組織修平整。將修切好的組織放于15%的蔗糖溶液內4°℃冰箱脫水沉底后轉入30%的蔗糖溶液內4℃冰箱脫水沉底。將脫好水的組織取出，用濾紙將表面水稍吸干后切面朝上放于包埋臺上，組織周圍滴上OCT包埋劑，將包埋臺放在冰凍切片機的速凍臺上速凍包埋，OCT變白變硬后即可進行切片。將包埋臺固定于切片機上，先粗切，將組織面修切平整后即可開始切片，切片厚度為8～10 μm。將干凈的載玻片平放于切出的組織片上方即可將組織貼于載玻片上。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 切片染色 新鮮組織固定于4%多聚甲醛24 h以上；將組織從固定液取出，在通風櫥內用手術刀將目的部位組織修平整。將修切好的組織放于15%的蔗糖溶液內4℃冰箱脫水沉底后轉入30%的蔗糖溶液內4℃冰箱脫水沉底。將脫好水的組織取出，用濾紙將表面水稍吸干后切面朝上放于包埋臺上，組織周圍滴上OCT包埋劑，將包埋臺放在冰凍切片機的速凍臺上速凍包埋，OCT變白變硬后即可進行切片。將包埋臺固定于切片機上，先粗切，將組織面修切平整后即可開始切片，切片厚度8～10 μm。將干凈的載玻片平放于切出的組織片上方即可將組織貼于載玻片上。-20℃保存?zhèn)溆谩?%冷的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3遍；與二抗相同宿主的血清封閉30 min，PBS洗3遍；一抗4℃濕盒內過夜，PBS洗3遍；二抗室溫2 h(避光)，PBS洗3遍；用DAPI染核10 min，PBS洗3遍，然后直接照熒光片。

2 結 果

2.1 實驗動物分析 納入動物數(shù)量24只，均進入結果分析，沒有脫落。

2.2 脛前筋膜室內壓監(jiān)測情況 正常組兔腿筋膜室壓力為(0.38±0.1)kPa，實驗組兔腿傷后4 h筋膜室壓力為(2.0±0.2)kPa，傷后8 h為(4.3±0.4)kPa，傷后1 d為(7.0±0.4)kPa，傷后3d為(4.9±0.3)kPa，傷后5 d為(4.5±0.3)kPa，傷后7d為(4.0±0.3 )kPa，傷后2周為(2.9±0.3)kPa，傷后4周為(0.6±0.1)kPa。結果示實驗兔腿與正常兔腿的筋膜室壓力間的差異具有統(tǒng)計學意義。在模型成功后實驗兔后腿的筋膜室內壓明顯上升，在1 d時，筋膜室壓力達到峰值，之后筋膜室壓力逐漸下降(P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義)。

2.3 兔骨筋膜室綜合征神經損傷后細胞增殖核抗原的變化 我們運用Western blot技術觀察兔骨筋膜室綜合征后PCNA時間依賴性表達，PCNA在對照組呈現(xiàn)出低表達，在兔骨筋膜室綜合征4 h后開始上調，5 d時表達達到最高峰(P<0.05)，然后，PCNA逐漸下降(見圖1)。這些結果表明PCNA蛋白質表達上調是由于骨筋膜室綜合征損傷誘導所致。

a Western blot結果

注：*代表與sham組(對照組)相比差異具有統(tǒng)計學意義

2.4 局部早期應用NGF治療神經損傷的組織形態(tài)學檢測 為了分析局部早期應用神經生長因子神經組織學和形態(tài)學的變化，我們運用石蠟組織切片進行HE染色來分析兔骨筋膜室綜合征神經損傷后的病理學特征。結果發(fā)現(xiàn)：未注射NGF組在損傷后5 d，可見神經纖維斷裂、水腫、空泡、形狀不規(guī)則的組織形態(tài)，而給予NGF注射的實驗組在同一時間點的組織形態(tài)要明顯好于未注射組(見圖2)。此實驗逐步表明，在早期給予NGF注射可對兔骨筋膜室綜合征神經損傷有一定的修復作用。

2.5 免疫熒光雙標分析注射神經營養(yǎng)因子后不同的細胞標記物熒光的共表達 進一步明確注射神經營養(yǎng)因子對兔骨筋膜室綜合征后與神經的恢復以及施旺細胞表達的狀況影響，我們運用免疫熒光技術取正常組和實驗組病變部位神經組織進行免疫熒光雙標。施旺細胞是外周神經中的特異性細胞，與外周神經細胞的修復和增殖有密切聯(lián)系。因此，考慮選擇施旺細胞作為檢測指標。分別用S100、DAPI標記施旺細胞以及細胞核，我們可以發(fā)現(xiàn)給予神經營養(yǎng)因子能夠明顯增加兔骨筋膜室綜合征后神經細胞增殖數(shù)量，而通過熒光雙標顯示，給予NGF注射后，S100和DAPI共標明顯增加。損傷5 d時，相對于對照組和未注射NGF組，NGF注射組中S100、DAPI的表達均明顯增加(見圖3)，而且兩者共標亦明顯增加，表明兔骨筋膜室綜合征后注射NGF，明顯促進了施旺細胞的增殖，進而促進神經損傷的修復。

a 對照組(×40) b 未注射NGF組(×40) c 注射NGF組(×40)

d 對照組(×200) e 未注射NGF組(×200) f 注射NGF組(×200)

圖2 實驗兔(對照組)、損傷后5 d(損傷未注射組)、損傷后5 d(損傷注射組)的兔后腿神經標本HE染色

a 對照組 b 未注射NGF組 c 注射NGF組

注：S100-綠色；DAPI-藍色

圖3 損傷后神經細胞和施旺細胞的共定位情況(×200)

3 討 論

骨筋膜室綜合征是四肢創(chuàng)傷中最為嚴重的疾病之一，多發(fā)生于四肢骨折后，少數(shù)無骨折僅軟組織嚴重損傷時也可形成，血管損傷、燒傷、醫(yī)源性損傷等均可引起。創(chuàng)傷后患肢肌肉、軟組織劇烈腫脹，致使骨筋膜的間隔膨脹，間隔壓力快速升高，肌肉、神經組織受壓，繼而出現(xiàn)張力性水皰、肌張力增高、肌肉大面積壞死、肢體感覺運動功能障礙等，嚴重時甚至引起多器官功能衰竭而導致死亡。因此，早期發(fā)現(xiàn)和及時手術是預防和治療骨筋膜室綜合征的重中之重。骨筋膜室綜合征后神經損傷的出現(xiàn)概率較高，出現(xiàn)的時間也比較早，而目前判斷神經損傷的方法多為肢體感覺運動情況的檢查，并沒有具體客觀的檢查指標，而且神經損傷的治療方法也很有限，尤其是神經損傷的早期治療多被忽視。本實驗的目的就是通過骨筋膜室綜合征動物模型研究早期神經損傷的時間、治療以及療效等。

動物試驗模型中，通過對試驗兔腿筋膜室壓力的動態(tài)測量，我們發(fā)現(xiàn)松開止血帶后筋膜室壓力隨之升高，在1 d時達到峰值，隨后逐漸下降。我們運用Western blot技術觀察兔骨筋膜室綜合征后PCNA時間依賴性表達，PCNA在對照組呈現(xiàn)出低表達，在兔骨筋膜室綜合征4 h后開始上調，5 d時表達達到最高峰(P<0.05)，然后，PCNA逐漸下降。這些結果表明PCNA蛋白質表達上調是由于骨筋膜室綜合征損傷誘導所致。實驗表明骨筋膜室綜合征早期即會引起神經損傷，并且在短期內會達到損傷的高峰。我們再運用石蠟組織切片進行HE染色來分析兔骨筋膜室綜合征神經損傷后的病理學特征。結果發(fā)現(xiàn)損傷后5 d，可見神經纖維斷裂、水腫、空泡、形狀不規(guī)則的組織形態(tài)；而給予NGF注射的實驗組在同一時間點的組織形態(tài)要明顯好于未注射組。HE染色結果提示早期局部使用NGF對于神經損傷的預防和修復具有明顯的效果。

在周圍神經系統(tǒng)中，施旺細胞(Schwann cells，SCs)是外周神經系統(tǒng)具有特異性的神經膠質細胞[3-4]，在神經損傷后的修復過程中發(fā)揮十分重要的作用。施旺細胞可分泌多種神經營養(yǎng)因子、黏附分子、細胞外基質分子，形成周圍神經再生的微環(huán)境，指導和支持神經的增殖和遷移[5]。周圍神經損傷后，巨噬細胞浸潤后形成炎癥反應，清除碎片并調節(jié)微環(huán)境以允許有效的再生[6]。施旺細胞與巨噬細胞合作，通過某些受體介導的吞噬作用以及自噬來清除髓鞘碎片，在體內獲得抗原呈遞功能并調節(jié)局部免疫反應和周圍神經疾病[7-8]。施旺細胞通過支持軸突生長和髓鞘形成在外周神經修復和再生中起關鍵作用[9-12]，是周圍神經系統(tǒng)再生能力不可或缺的部分[12-13]。迄今為止，施旺細胞被認為是用于周圍神經系統(tǒng)損傷或退行性疾病的活細胞療法的最有希望的候選者[14]。

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是一種神經細胞生長的調節(jié)因子，具有營養(yǎng)神經和促神經生長的功能。它不僅僅作用于中樞神經系統(tǒng)，同時也在周圍神經系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調控作用[15]。既然NGF和施旺細胞均在神經細胞的修復過程中發(fā)揮著重要的作用，那么兩者之間是否存在一定的聯(lián)系？

為了進一步明確注射神經營養(yǎng)因子對兔骨筋膜室綜合征后對神經的恢復以及施旺細胞表達的狀況影響。我們運用免疫熒光技術取對照組和實驗組病變部位神經組織進行免疫熒光雙標。S100存在于培養(yǎng)的施旺細胞中并且可能對周圍神經損傷發(fā)揮旁分泌作用，是施旺細胞的特異性標記物[16]。分別用S100、DAPI標記施旺細胞以及細胞核，我們可以發(fā)現(xiàn)給予神經營養(yǎng)因子能夠明顯增加兔骨筋膜室綜合征后神經細胞增殖數(shù)量，而通過熒光雙標顯示，給予NGF注射后，S100和DAPI共標明顯增加，表明兔骨筋膜室綜合征后早期局部注射NGF可以促進施旺細胞增殖。施旺細胞的增殖可以促進髓鞘修復，誘導軸突再生，加速神經元的生長和修復，同時一定程度抑制神經細胞的凋亡，避免神經受損進一步加重。

骨筋膜室綜合征的處理應著重于早期預防、早期診斷以及早期治療。在臨床治療的同時，需要密切監(jiān)測患肢神經的情況，對于早期可能會出現(xiàn)或者已經出現(xiàn)神經損傷表現(xiàn)的，早期連續(xù)局部注射NGF的治療方法給廣大醫(yī)務工作者提供了一個選擇。同時臨床實際應用中存在著許多的不可預知性，藥品的來源、給藥技術、療效評估、起效時間、不良反應、醫(yī)源性損傷等方面均需要進一步的研究。但是我相信本實驗不僅提供了一定的實驗數(shù)據(jù)，更為臨床治療提供了新的理論和技術支持，具有廣闊的應用前景。