不同RNA提取方法的效能比較

李冉冉，王 兵，胡 勝，李 洋，翟永杰，李彩霞,5，孫啟凡,*，季安全,*

（1.公安部物證鑒定中心，北京市現(xiàn)場物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心，山東 濟(jì)寧 272067；3.西安市公安局未央分局，西安 710016；4.呼和浩特市公安局，呼和浩特 010090；5.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001）

微RNA（MicroRNA，miRNA），因其分子量小、拷貝數(shù)高、具有組織特異性，并且在極端外部環(huán)境如高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等條件下亦不易降解等特點(diǎn)而受到法醫(yī)業(yè)界的關(guān)注[1-2]。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，miRNA在人類生命體中的作用也逐漸被挖掘，越來越多的研究表明miRNA在生命過程中所起到的作用遠(yuǎn)比預(yù)想的重要。其中，miRNA在體液鑒定、死亡時(shí)間推斷、年齡推斷、同卵雙生子甄別等方面均具有法醫(yī)學(xué)可應(yīng)用性[3-4]。目前在體液鑒定和死亡時(shí)間推斷方面已經(jīng)取得了一定成效，有望為法醫(yī)實(shí)踐中重塑案件經(jīng)過、揭露犯罪事實(shí)提供科學(xué)可靠的依據(jù)。

將miRNA應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐，要求提取到純度高并且完整性好的miRNA。提取的miRNA的數(shù)量和質(zhì)量是Realtime PCR的基礎(chǔ)和前提。然而由于miRNA分子量小，很難從樣本中直接提取到miRNA，所以需要提取高質(zhì)量的總RNA，從而間接評(píng)估m(xù)iRNA的質(zhì)量。多種針對(duì)RNA提取的商業(yè)化試劑盒陸續(xù)問世并越來越多得到使用，本實(shí)驗(yàn)選取6種商業(yè)化RNA提取試劑盒，并結(jié)合Trizol有機(jī)提取法，對(duì)外周血中的總RNA進(jìn)行提取，以比較不同試劑盒提取RNA的純度、產(chǎn)量以及RNA的完整性，同時(shí)選取在各組織中穩(wěn)定表達(dá)的基因RNU6b[5-6]，使用Realtime PCR方法檢測其表達(dá)量，以進(jìn)一步判斷不同RNA提取試劑盒的實(shí)際提取效果。

1 材料

1.1 樣本采集與準(zhǔn)備

根據(jù)知情同意原則采集5個(gè)無關(guān)漢族個(gè)體（年齡在23～35周歲）的新鮮靜脈血液，每個(gè)個(gè)體靜脈血以移液器吸取170 μL的等份滴于7個(gè)棉簽上，所有樣本在相同條件（光照、溫度、濕度、放置時(shí)間）下晾干，-80 ℃存儲(chǔ)備用。

1.2 RNA提取方法

用以下7種提取方法從上述處理過的樣本中提取RNA，所有實(shí)驗(yàn)操作均按說明書進(jìn)行，稍作調(diào)整 ：1）miRNeasy?Mini 試劑盒（Qiagen，德國）；2）RNeasy?Micro 試劑盒（Qiagen，德國）；3）Trizol有機(jī)提取法；4）mirVanaTMmiRNA Isolation 試劑盒（Ambion,美國）；5）RNeasy?Plus Micro 試劑盒（Qiagen，德國）；6）ALLPrep?DNA/RNA Micro 試劑盒（Qiagen，德國）；7）PureLinkTMRNA Mini 試劑盒(Invitrogen，美國)。整個(gè)RNA提取定量及檢測流程見圖1。

圖1 RNA提取實(shí)驗(yàn)全過程示意圖Fig.1 Schematic for the procedures of RNA extraction

在提取之前用75%酒精擦拭所有儀器和設(shè)備以除去其表面的RNA酶和周圍環(huán)境中的核酸。并且只用去除了RNA酶的試劑和耗材提取RNA[7]。晾干的靜脈血棉簽在提取之前置于2 mL EP管中，加入500μL Depc水后渦旋震蕩，室溫15 min孵育后將溶解產(chǎn)物與固體棉簽分開，盡量吸干棉簽上液體而后丟棄棉簽，液相用于后續(xù)提取。

上述7種提取方法都可從組織或者細(xì)胞中提取包括miRNA在內(nèi)的總RNA，每個(gè)提取方法除了圖1展示的在加入裂解液后是否需要液相分離、是否需要β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）的區(qū)別外，各自仍需注意的步驟，詳見各說明書。

每種提取方法重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA質(zhì)量檢測

1.3.1 RNA質(zhì)量檢測

用nanodrop 2000c（Thermo Scientific，美國）紫外分光光度計(jì)測定總RNA的濃度、OD260/280，總RNA純度由OD260/280判斷。

在測定每一個(gè)樣本之前都要用nuclease-free water來校正，以避免樣本之間交叉污染。

1.3.2 RNA完整性分析

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性（120 V的電壓下電泳30 min），用凝膠成像儀成像取圖，要求總RNA樣品電泳條帶清晰，28S rRNA條帶亮度不低于18S rRNA條帶的亮度。

1.4 反轉(zhuǎn)錄及Realtime PCR檢測

選用管家基因RNU6b，采用SYBR Green技術(shù)進(jìn)行Realtime PCR檢測，樣本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后在Quant-StudioTM7 Flex Realtime PCR System （Applied Biosystems，美國）上進(jìn)行檢測，所有樣本反應(yīng)體系及參數(shù)設(shè)定均相同。

1.4.1 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，包含10.3 μL去核酸酶水，4 μL 的 5×First-Strand Buffer，2 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL 反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV（200 U/μL），1 μL 特異莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物（1 μmol/L），1 μL的MicroRNA樣本，0.5 mL的dNTP（10 mmol/L），0.2 μL的重組核糖核酸酶抑制劑Recombinant RNasin?RNase Inhibitor（40 U/μL）。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?16 ℃30 min，37 ℃30 min，65 ℃5min。用去核酸酶的水替代反轉(zhuǎn)錄酶設(shè)置陰性對(duì)照。

1.4.2 Realtime PCR

Realtime PCR反應(yīng)在QuantStudioTM7 Flex Realtime PCR System （Applied Biosystems，美國）上進(jìn)行，反應(yīng)體系為10 μL。擴(kuò)增引物利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)。Realtime PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含5 μL PowerSYBR Green PCR 反應(yīng)混合液 (2×)，4 μL去核酸酶水，0.5 μL上下游引物混合物(10 μmol/L)，0.5 μL cDNA模板。Realtime PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃10 min；之后 95 ℃15 s，60 ℃1 min，共 40 個(gè)循環(huán)；在95 ℃15 s，60 ℃1 min條件下作熔解曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA nanodrop 2000c結(jié)果

表1和表2分別展示了7種不同提取方法所提取的RNA總量和純度。由表1可知，不同的試劑盒所提RNA之間總量相差較大，其中MiRNeasy?Mini試劑盒所提RNA總量最高，平均總量在(2410.50±189.54) ng到(3860.50±182.12) ng之間；其次是Trizol有機(jī)提取法所提取的RNA，平均總量介于 (1353.50±78.87) ng與 (2418.00±307.33)ng之間；再者是mirVanaTMmiRNA Isolation試劑盒，其提取的RNA總量最高可達(dá)(1211.00±250.19) ng；其他的幾種提取方法提取的RNA總量差別不大，相比上述3種方法，所提取的RNA總量偏低，大約介于(31.50±1.50) ng到(553.00±409.70) ng。

由表 2可見 MiRNeasy?Mini試劑盒、Trizol有機(jī)提取法和PureLinkTMRNA Mini試劑盒所提RNA的OD260/280都在標(biāo)準(zhǔn)值1.80～2.0之間，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。而 RNeasy?Micro、RNeasy?Plus Micro兩種試劑盒所提取的外周血RNA的純度不完全符合標(biāo)準(zhǔn)，樣本純度的合格率也不如上述3種方法。ALLPrep?DNA/RNA Micro試劑盒所提RNA則完全不符合標(biāo)準(zhǔn)，純度（OD260/280）＞2.0，亦不符合要求。

表1 7種提取方法提取的外周血的RNA總量（ng）Table 1 The gross amount of RNA extracted from the peripheral bloods by seven selected methods (ng)

表2 7種提取方法提取的外周血的RNA的平均純度（OD260/280）Table 2 The average purity (OD260/280) of the RNA extracted from peripheral bloods by seven selected methods

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)提取的RNA電泳檢測，從圖2可見，MiRNeasy?Mini試劑盒、Trizol、mir-VanaTMmiRNA Isolation試劑盒、RNeasy?Plus Micro試劑盒、ALLPrep?DNA/RNA Micro試劑盒5種方法提取的RNA的28S rRNA的亮度明顯高于18S rRNA條帶的亮度，并且28S rRNA與18S rRNA的條帶都均勻且完整。RNeasy?Micro、PureLinkTMRNA Mini兩試劑盒提取的RNA的28S rRNA與18S rRNA條帶相對(duì)完整但稍有彌散。

2.3 Realtime PCR結(jié)果

通過Realtime PCR技術(shù)檢測不同方法所提取樣本中管家基因RNU6b的表達(dá)量，來評(píng)價(jià)不同試劑盒的提取效能。其中Ct值（C: cycle, t: threshold，Ct值指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）越小，miRNA的表達(dá)含量越高，即提取效能越高。

由圖3可見，7種不同的提取方法所提取的RNA通過RNU6b檢測均可得到清晰的擴(kuò)增曲線，表明miRNA表達(dá)良好。MiRNeasy?Mini試劑盒、Mir-VanaTMmiRNA Isolation試劑盒、Trizol法提取的產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的Ct值最小，在16～18之間，不同樣本間Ct值相差很小；PureLinkTMRNA Mini試劑盒提取的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的 Ct值在 18～20之間；RNeasy?Micro 試劑盒提取的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)Ct值在17～23之間，不同的樣本之間Ct相差較大；RNeasy?Plus Micro試劑盒提取的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)Ct值在23～29之間，不同的樣本之間Ct相差也較大；ALLPrep?DNA/RNA Micro試劑盒提取的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)Ct值在23～25之間。

圖2 7種方法提取RNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 (a. miRNeasy? Mini; b. RNeasy? Micro; c. Trizol; d. mirVanaTM miRNA Isolation; e.RNeasy? Plus Micro; f. ALLPrep? DNA/RNA Micro; g. PureLinkTM RNA Mini)Fig.2 Total RNA electrophoresed in 1.0% agar-gel after extracted by one of seven selected methods as indicated in the parentheses (a. miRNeasy? Mini Kit; b. RNeasy? Micro Kit; c. Trizol; d. mirVanaTM miRNA Isolation Kit; e. RNeasy? Plus Micro Kit; f. ALLPrep? DNA/RNA Micro Kit; g. PureLinkTM RNA Mini Kit)

圖3 7種方法提取的RNA的Realtime PCR擴(kuò)增曲線圖 (a. miRNeasy? Mini; b. RNeasy? Micro; c. Trizol; d. mirVanaTM miRNA Isolation; e.RNeasy? Plus Micro; f. ALLPrep? DNA/RNA Micro; g. PureLinkTM RNA Mini)Fig.3 Realtime PCR ampli fi cation curves of the RNA extracted by one of seven methods as indicated in the parentheses (a. miRNeasy?Mini Kit; b. RNeasy? Micro Kit; c. Trizol; d. mirVanaTM miRNA Isolation Kit; e. RNeasy? Plus Micro Kit; f. T ALLPrep? DNA/RNA Micro Kit; g. PureLinkTM RNA Mini Kit)

3 討論

不同組織中的RNA受外界環(huán)境中無處不在的核糖核酸酶（RNase）以及樣本保存過程中溫度、保存時(shí)間、凍融次數(shù)、紫外照射與否、pH值等理化因素的影響，提取相對(duì)困難，這成為利用RNA進(jìn)行Realtime PCR檢測、建立cDNA文庫及表達(dá)和調(diào)控等研究的障礙[8-9]。理想的RNA提取試劑盒應(yīng)該能夠在復(fù)雜環(huán)境下從不同的檢測樣本中提取到充足量的RNA，因此挑選出合適的試劑盒十分必要。本實(shí)驗(yàn)各提取方法皆選取相同條件處理得到的樣本，避免了樣本差異對(duì)試劑盒提取結(jié)果帶來的影響。

Trizol有機(jī)提取法可直接從組織或者細(xì)胞中提取總RNA，能夠迅速裂解細(xì)胞釋放出RNA，并且能夠抑制細(xì)胞裂解產(chǎn)生出的核酸酶，從而可保護(hù)RNA分子的完整性[10]，而用氯仿分離RNA后，異丙醇起到沉淀RNA的作用，在本次實(shí)驗(yàn)中加入異丙醇后由常規(guī)的室溫放置10 min改為在-20 ℃放置4 h，更能充分地將RNA沉淀，提高了RNA的產(chǎn)量。Trizol操作簡便快捷并且所用試劑（氯仿、異丙醇、乙醇等）價(jià)格低廉，對(duì)設(shè)備的要求低，但此方法要將裂解出來的RNA、苯酚以及其他試劑保留在同一離心管中，不能有效去除雜質(zhì)，使得RNA的純度較低。本實(shí)驗(yàn)中使用該方法提取的RNA的純度雖符合標(biāo)準(zhǔn)，但相比試劑盒MiRNeasy?Mini（Qiagen，德國）純度稍低。

試 劑 盒 MiRNeasy?Mini（Qiagen， 德 國 ） 經(jīng)QIAzol裂解液和氯仿萃取的上清，使用陰離子交換柱而選擇性結(jié)合RNA，可濾去蛋白質(zhì)和其他小分子雜質(zhì)。后用Buffer RWT與RPE緩沖洗脫液，再去除蛋白質(zhì)、抑制劑和其他雜質(zhì)。該方法既有效去除雜質(zhì)又兼具濃縮功能，因而能獲得濃度高、純度好的RNA樣本，且操作簡單、耗時(shí)短。

其他4種試劑盒RNeasy?Micro、ALLPrep?DNA/RNA Micro、RNeasy?Plus Micro、PureLinkTMRNA Mini其提取方法均使用β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol），對(duì)皮膚、上呼吸道粘膜以及眼睛會(huì)有一定損傷，并且試劑盒PureLinkTMRNA Mini的裂解和洗脫緩沖液都含有異硫氰酸胍，直接把漂白劑或者酸性液體加入包含異硫氰酸胍緩沖液或者樣品準(zhǔn)備的廢液中，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)生化合物和有毒氣體，對(duì)操作者有可能造成損傷。由此，7種方法的提取產(chǎn)物經(jīng)過nanodrop 2000c定量、瓊脂糖凝膠電泳和Realtime PCR檢測，綜合比較可知，試劑盒MiRNeasy?Mini、Trizol提取法提取的RNA質(zhì)量更優(yōu)，總量也高于其他試劑盒；提取的RNA純度還高，OD260/280都在標(biāo)準(zhǔn)值1.80～2.0之間，表明所提RNA雜質(zhì)少，蛋白質(zhì)、酚類去除充分；并且提取的RNA中28S rRNA條帶的亮度明顯高于18S rRNA、條帶又都均勻完整，不存在彌散現(xiàn)象，顯示提取的RNA完整、純度高且沒有降解。

綜上可見，Trizol提取法和試劑盒MiRNeasy?Mini均可用于外周血中RNA的提取，但從節(jié)約時(shí)間，提高RNA質(zhì)量的角度考慮，MiRNeasy?Mini試劑盒更宜作為優(yōu)選方案。