脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對輸血相關(guān)急性肺損傷大鼠巨噬細(xì)胞表面TLR4及CD40 的影響

王景順

(漯河市中心醫(yī)院 漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院輸血科，河南 漯河 462000)

輸血相關(guān)急性肺損傷(TRALI)是指經(jīng)過輸血或血液相關(guān)制品后引起的肺組織急性損傷，發(fā)病急，死亡率高，可達(dá)14%〔1～6〕。TRALI多表現(xiàn)為呼吸衰竭及肺水腫，因輸血引起的肺水腫為非心源性。TRALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明確，已有研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞激活及巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體(TLR)4、CD40 表達(dá)的改變是 TRALI 發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔7～9〕。干細(xì)胞是一類能夠在特定條件下分化成各種組織器官的細(xì)胞〔10～14〕，大量研究將干細(xì)胞移植運(yùn)用于各種疾病的治療，已經(jīng)取得了令人矚目的進(jìn)展〔15～23〕，包括對TRALI的改善及治療。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)不僅來源廣泛，而且具有較強(qiáng)的分化及增殖能力〔24～32〕，成為繼骨髓干細(xì)胞之后的又一熱點(diǎn)。本研究旨在探究ADMSCs對巨噬細(xì)胞表面TLR4、CD40 的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性SD大鼠，4～5周齡，體重(240±20)g，由河南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心提供。

1.2主要材料及來源 脂多糖(LPS，美國Sigma-Aldrich)、腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-1β及缺血預(yù)適應(yīng)上調(diào)蛋白(MIP)-2 的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(USA R&D)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、8-羥基脫氧鳥嘌呤氯甲基苯甲酰氨(OhdG)蛋白測定試劑盒(南京邁博生物科技有限公司)、氯甲基苯甲酰氨(CM-DiI)細(xì)胞標(biāo)記液(美國Molecular Probes公司)、顯微鏡(Leica 公司)、流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司產(chǎn)品)、離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)

1.3體外培養(yǎng)ADMSCs 大鼠腹腔注射麻醉，固定，手術(shù)刀切開皮膚，取5 g左右大鼠附睪處脂肪組織置于培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入將200 U/ml青霉素及200 U/ml鏈霉素，將磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后的脂肪組織剪成乳糜樣顆粒，首先加入0.25%胰蛋白酶除去結(jié)締組織，然后加入適量的Ⅰ型膠原酶去除脂肪消化，60 min后取出培養(yǎng)皿，棄上清液，剩余的懸濁液經(jīng)濾網(wǎng)過濾后收集于離心管中，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS再次沖洗2遍，再離心，棄上清，上訴步驟重復(fù)3次后加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后換新的培養(yǎng)基，棄上清同時(shí)將未貼壁的細(xì)胞一同棄去，之后每隔1 d以同樣的方法更換一次培養(yǎng)基，同時(shí)察看細(xì)胞的生長情況〔33〕。

1.4大鼠TRALI模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、TRALI 組及移植組各10只。經(jīng)腹腔注射2 mg/kg LPS，注射完畢2 h后麻醉，經(jīng)股靜脈抽約1 ml血液，再注入等量人血漿。移植組小鼠采用同上述方法，注射完血漿后注入1 ml ADMSCs混懸液；而假手術(shù)組采用TRALI組同樣的方法后注射1 ml生理鹽水〔34〕。

1.5熒光顯微鏡觀察CM-Dil標(biāo)記的ADMSCs存活及分布情況 移植組大鼠處死后取少許肺組織，加入適量的胰酶及乙二胺四乙酸進(jìn)行細(xì)胞消化，經(jīng)過一定時(shí)間后加入含血培養(yǎng)基停止消化。吸取少量細(xì)胞液于離心管中離心，隨后反復(fù)沖洗后加入適量CM-DiI細(xì)胞標(biāo)記液，用膠頭滴管反復(fù)吹打細(xì)胞液使細(xì)胞與標(biāo)記液充分接觸，標(biāo)記完畢將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育，20 min后取出細(xì)胞液再次離心、洗滌后，加入少量臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)，將已標(biāo)記CM-DiI的ADMSCs繼續(xù)培養(yǎng),在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及形態(tài)變化。

1.6ELISA檢測血清及肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2 的含量 分別抽取等量血液，然后處死大鼠，取肺組織消化離心后制成細(xì)胞液備用。分別從各組中吸取少量的血液及細(xì)胞液加入到板條空白孔中，做好標(biāo)記，用封板膠紙進(jìn)行封閉后置于特定條件下培養(yǎng)，90 min后取出，將各板孔反復(fù)沖洗，然后加入等劑量生物素化抗體，再次封孔培養(yǎng)1 h，取出，反復(fù)洗滌，加入等量的酶結(jié)合物工作液在上述相同條件下孵育，30 min后洗滌，加入顯色液30 min反復(fù)沖洗，加入終止液使反應(yīng)停止，置于酶標(biāo)儀上測定，TNF-α、IL-1β及MIP-2 均為已知消光系數(shù)的化合物。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測大鼠肺組織TLR4、CD40、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB基因相對表達(dá)量 肺組織加入適量Trizol提取總RNA，按照Fermentas 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書合成第一條cDNA，依此為模板逆轉(zhuǎn)錄，然后對TLR4、CD40、NF-κB基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別測定TLR4、CD40、NF-κB基因的表達(dá)量。TLR4引物序列:上游引物5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′，下游引物5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′，反應(yīng)產(chǎn)物為548 bp。CD40引物序列:上游引物5′-CTTCTTCCGACCGTGACATGC-3′,下游引物5′-ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAG-3′，擴(kuò)增后 DNA片段長330 bp。NF-κB引物序列：上游引物5′-ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3′，下游引物5′-TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT-3′，產(chǎn)物長度217 bp。β-actin引物序列:上游引物5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，下游引物5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′,反應(yīng)產(chǎn)物為300 bp。TLR4、CD40、NF-κB產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物光密度積分的比值作為TLR4、CD40、NF-κB mRNA的表達(dá)量。

1.8外周血巨噬細(xì)胞檢測TLR4、CD40、NF-κB的mRNA 表達(dá)量 經(jīng)離心等相關(guān)操作后從大鼠血液提取出巨噬細(xì)胞，并提取總RNA，按照試劑說明書合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，對 TLR4、NF-κB、CD40 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，計(jì)算mRNA 含量，整個(gè)操作按照相關(guān)說明進(jìn)行。

1.9采用放射免疫沉淀試劑盒檢測SOD、GSH、MDA、8-OhdG 含量 肺組織加入生理鹽水制成勻漿,分別取出少量勻漿進(jìn)行離心，取上清液用于SOD、GSH、MDA、8-OhdG 含量測定，整個(gè)操作均按照試劑說明進(jìn)行。

1.10采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠肺組織病理變化及計(jì)算濕干比 取雙側(cè)肺組織加10%甲醛固定24 h后，用石蠟包埋，切片(切片厚度應(yīng)均勻)，HE染色，將切片封固及烤干后放在顯微鏡下觀察。取肺組織，置于錫箔紙上，將錫箔紙的質(zhì)量設(shè)定為W0，將放有肺組織的錫箔紙一起稱量，質(zhì)量設(shè)定為W1，肺組織濕重為W1-W0。烘干72 h后取出再次稱重，得W2，組織干重為W2-W0，組織濕重與干重的比值即為濕干比。

1.11統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ADMSCs存活及分布情況 熒光顯微鏡下可見經(jīng)過標(biāo)記及臺盼藍(lán)染色后的細(xì)胞生長良好，經(jīng)過標(biāo)記的細(xì)胞顯紅色熒光，陽性標(biāo)記率達(dá)98%以上。細(xì)胞形態(tài)呈梭形，形態(tài)良好，而早期細(xì)胞內(nèi)含有較多的熒光顆粒，細(xì)胞核卻不被染色，見圖1。

圖1 CM-DiI標(biāo)記的ADMSCs(×200)

2.2各組血清及肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2含量 與假手術(shù)組相比，TRALI 組血清和肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2濃度明顯增高(P<0.05)。與TRALI 組相比，移植組血清和肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清及肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2含量

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與TRALI組比較：2)P<0.05；下表同

2.3各組肺組織TLR4、CD40、NF-κB mRNA相對表達(dá)量 與假手術(shù)組相比，TRALI 組肺組織TLR4、CD40、NF-κB mRNA 表達(dá)量均顯著增高(P<0.05)；而與TRALI 組相比，移植組TLR4、CD40、NF-κB mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肺組織TLR4、CD40、NF-κB mRNA表達(dá)量比較

圖2 各組肺組織TLR4、CD40、NF-κB mRNA相對表達(dá)量

2.4各組外周血巨噬細(xì)胞中TLR4、CD40、NF-κB mRNA表達(dá)量 與假手術(shù)組比較，TRALI 組巨噬細(xì)胞中TLR4、CD40、NF-κB mRNA 表達(dá)量顯著增高(P<0.05)；與TRALI 組相比，移植組TLR4、CD40、NF-κB mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組外周血巨噬細(xì)胞中TLR4、CD40、NF-κB表達(dá)量

圖3 各組外周血巨噬細(xì)胞中TLR4、CD40、NF-κB mRNA的表達(dá)

2.5肺組織SOD、GSH、MDA、8-OhdG含量 TRALI組肺組織SOD、GSH含量顯著低于假手術(shù)組，MDA、8-OhdG 含量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；移植組SOD、GSH含量顯著高于TRALI 組，MDA、8-OhdG含量顯著低于TRALI 組(P<0.05)。見表4。

表4 各組肺組織SOD、GSH、MDA、8-OhdG 含量檢測結(jié)果

2.6各組肺組織病理變化 顯微鏡下假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小較為一致，肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)正常，肺泡間隔厚度正常，肺泡腔內(nèi)無纖維蛋白，也未見明顯出血。TRALI組肺間質(zhì)水腫、出血，炎癥反應(yīng)加重，肺泡間隔增厚、肺泡內(nèi)纖維蛋白浸潤、肺泡內(nèi)出血、支氣管壁增厚。移植組的各種病理變化較TRALI 組明顯好轉(zhuǎn)。見圖4。

圖4 各組肺組織病理變化(HE，×200)

2.7各組肺組織濕干比 TRALI組肺組織濕干比(3.96±0.49)顯著低于假手術(shù)組(5.45±0.68)和移植組(4.16±0.73；P<0.05)。

3 討 論

TRALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，大量研究表明TRALI發(fā)病最可能的機(jī)制為“二次打擊”〔35～39〕。本研究采用“二次打擊”機(jī)制進(jìn)行TRALI模型制備，首先對造模小鼠腹腔注射適量LPS為TRALI發(fā)生的第1事件；注射LPS后機(jī)體立刻啟動(dòng)免疫系統(tǒng)，經(jīng)過2 h后再經(jīng)尾靜脈給予人血漿為TRALI發(fā)生的第2事件。研究發(fā)現(xiàn)，肺泡腔內(nèi)充滿巨噬細(xì)胞，認(rèn)為巨噬細(xì)胞是肺部炎癥反應(yīng)的一個(gè)調(diào)節(jié)閥，當(dāng)受到兩次打擊后調(diào)節(jié)閥打開，炎癥反應(yīng)被激活，通過一系列炎癥連鎖反應(yīng)最終導(dǎo)致 TRALI形成〔40〕。TLR4是巨噬細(xì)胞表面的一個(gè)受體，在第一次打擊事件中TLR4是LPS的重要受體，LPS通過與TLR4結(jié)合進(jìn)一步激活 NF-κB，進(jìn)而啟動(dòng)多種炎癥介質(zhì)表達(dá)〔41〕。除此之外，被激活后的NF-κB 還可以促進(jìn)共刺激分子CD40表達(dá)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)〔42〕。目前已有研究表明TLR4 和 CD40的過度表達(dá)是導(dǎo)致TRALI 發(fā)病的重要環(huán)節(jié)〔43～46〕。TRALI 時(shí)大鼠體內(nèi)活化巨噬細(xì)胞表面 TLR4 及 CD40表達(dá)量顯著升高，進(jìn)而會通過一系列炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等環(huán)節(jié)造成肺損傷〔47～49〕。

本研究提示TRALI后TLR4及CD40表達(dá)量明顯上升，誘發(fā)炎癥等一系列反應(yīng)，ADMSCs移植后可減輕肺損傷程度。