鮑曼不動桿菌外膜蛋白A通過Akt/mTOR/p70S6K信號通路引起RAW264.7細(xì)胞自噬*

安志遠(yuǎn)， 丁文一， 鄭春明， 黃驍舾

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心， 北京 100020； 2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科， 北京 100730)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種重要的臨床機會致病菌，可以引起呼吸機相關(guān)肺炎、敗血癥和泌尿道感染等感染性疾病。近年來臨床上出現(xiàn)了多耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌，給治療帶來極大困難[1-3]。目前已知鮑曼不動桿菌的外膜蛋白在其引起細(xì)胞毒性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[4-6]，其中外膜蛋白A(outer membrane protein A，OmpA)是鮑曼不動桿菌主要毒力蛋白，它可以導(dǎo)致包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子及引發(fā)凋亡[7-8]。但其是否可以引起宿主細(xì)胞自噬還不清楚。

自噬是機體應(yīng)對應(yīng)激和感染等外界不利因素，吞噬降解胞質(zhì)中受損的細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程[9]。自噬的發(fā)生和發(fā)展需要多種自噬蛋白共同完成，其中LC3對于自噬的活化至關(guān)重要，自噬體膜形成的過程中，胞漿中的LC3-I會與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成的共軛LC3的磷脂酰乙醇胺，即LC3-II，它是自噬體活化的分子標(biāo)志[10]。研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌及其毒力因子可以引起細(xì)胞自噬，自噬作用對于細(xì)胞清除細(xì)菌感染起到積極作用[11-12]。2016年，Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌可以引起HeLa細(xì)胞自噬，但卻不清楚是何種毒力因子引發(fā)的自噬。本實驗室先前通過構(gòu)建OmpA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞過表達(dá)OmpA，證實其可以引起HeLa細(xì)胞自噬[14]，但到目前還不知道OmpA是否可以引起宿主免疫細(xì)胞自噬，為了進(jìn)一步證實OmpA對免疫細(xì)胞的自噬作用及具體的分子機制，本研究將分析鮑曼不動桿菌OmpA對RAW264.7細(xì)胞的自噬作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

鮑曼不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC? 19606TM)的OmpA由本實驗室表達(dá)純化；抗LC3A/B、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K和β-actin抗體購自CST；雷帕霉素(rapamycin，Rapa)購自Sigma；抗兔熒光II 抗購自中杉金橋生物公司；RIPA細(xì)胞裂解液購自Beyotime。蛋白質(zhì)電泳儀(Bio-Rad)；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(Leica)；HT7700透射電子顯微鏡(Hitachi)；其余試劑為進(jìn)口和國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(ATCC?TIB-71TM)購自美國模式菌種保藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素購自Gibco。細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清和1%青、鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

2.2Western blot分析 分別收集10 mg/L OmpA刺激不同時間(0、6、12和24 h)或用5和10 mg/L OmpA刺激24 h的RAW264.7細(xì)胞，PBS緩沖液潤洗3次，用RIPA裂解液在冰上裂解細(xì)胞20 min，12 000×g離心10 min收集蛋白上清備用。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。用10%或15% SDS-PAGE，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 μm或0.45 μm的PVDF膜(Merck Millipore)上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，剪下目的條帶并和相應(yīng)的 I 抗在4 ℃孵育過夜，隔天TBST洗膜3次，每次10 min,之后與熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體或山羊抗小鼠抗體(1∶15 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次,每次10 min，再用Odyssey? CLx成像系統(tǒng)(LI-COR Bioscences)檢測蛋白表達(dá)，最后用ImageJ軟件分析灰度值。

2.3透射電子顯微鏡觀察自噬體 RAW264.7細(xì)胞以5×104的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后用10 mg/L OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞24 h，300×g離心5 min收集細(xì)胞沉淀，用2.5%的戊二醛在4 ℃下固定2 h，PBS洗3遍；用1%的鋨酸室溫固定2 h，PBS洗3遍；用梯度乙醇(50%、70%、80%、90%,每步10 min)對細(xì)胞組織進(jìn)行脫水、滲透。將組織放入環(huán)氧樹脂中包埋，之后用超薄切片機(Leica)將細(xì)胞組織切割成70 nm厚度，最后用醋酸鈾和硝酸鉛染色。將制備好的切片用透射電子顯微鏡獲取高分辨率圖像。

2.4細(xì)胞免疫熒光染色 將10 mg/L OmpA刺激24 h的RAW264.7細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，之后加入0.3% Triton X-100通透10 min，3% BSA室溫封閉1 h，之后加入抗LC3A/B抗體，4 ℃孵育過夜，之后用PBS洗3次，每次5 min,加入抗兔熒光 II 抗室溫孵育1 h，細(xì)胞核用1 mg/L DAPI染色，圖像用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計作圖，用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有的實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，差異顯著性用Student’st-test或用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序隨后進(jìn)行Bonferroniposthoctest分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鮑曼不動桿菌OmpA引起RAW264.7細(xì)胞自噬

細(xì)胞免疫熒光顯示,10 mg/L的OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生了大量的LC3熒光斑點狀聚集，而未處理組未觀察到LC3熒光斑點狀聚集，見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞6 h后可使LC3B-II表達(dá)升高，24 h時表達(dá)達(dá)到高峰，說明OmpA引起RAW264.7細(xì)胞自噬具有時間依賴性，量化統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OmpA刺激組中的LC3B-II表達(dá)量隨著時間延長而逐漸增高，與未刺激組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見圖1B。最后我們通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)OmpA可以導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生典型的雙層囊泡類似洋蔥皮樣結(jié)構(gòu)的自噬小體(黑色箭頭所示)，而未處理組中細(xì)胞形態(tài)完整，各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，沒有發(fā)生自噬現(xiàn)象,見圖1C。

Figure 1.OmpA triggered autophagy in RAW264.7 cells. A: confocal microscopic detection of LC3 levels in 10 mg/L OmpA-stimulated or control RAW264.7 cells for 24 h (scale bar=10 μm); B: RAW264.7 cells were stimulated with 10 mg/L OmpA for 0 h, 6 h,12 h and 24 h,and the expression level of LC3B was detected by Western blot; C: transmission electron microscopy showed that 10 mg/L OmpA stimulate RAW264.7 cells for 24 h to induce autophagosome formation (the black arrows indicated typical autophagosomes; the scale bar of C1 and C2=1 μm; the scale bar of C3=200 nm). Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs 0 h.

2 鮑曼不動桿菌OmpA通過Akt/mTOR/p70S6K信號通路引起RAW264.7細(xì)胞自噬

為了知道OmpA激活RAW264.7細(xì)胞自噬的具體信號途徑，我們檢測了自噬通路中mTOR分子及其上游分子Akt和下游分子p70S6K的磷酸化改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mg/L的OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞不同時間(0、6、12和24 h)后可以引起Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化水平降低，具有時間依賴性，量化統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpA刺激組中Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化隨著時間延長而逐漸降低，與未刺激組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖2A。不同濃度(0、5和10 mg/L)的OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后也可引起Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化降低，具有劑量依賴性,量化統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化隨著OmpA刺激濃度的增高而逐漸降低，與未刺激組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖2B。另外，我們用mTOR的特異性抑制劑rapamycin(400 nmol/L)預(yù)先作用RAW264.7細(xì)胞6 h，之后用10 mg/L濃度的 OmpA刺激24 h后檢測mTOR和p70S6K的磷酸化及LC3B表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpA和rapamycin共孵育的RAW264.7細(xì)胞中mTOR和p70S6K的磷酸化程度比單純OmpA刺激組進(jìn)一步降低，而LC3B-II的表達(dá)水平比單純OmpA刺激組顯著提高(P<0.01)，證明OmpA通過Akt/mTOR/p70S6K信號通路誘導(dǎo)了RAW264.7細(xì)胞自噬，見圖2C。

討 論

鮑曼不動桿菌的OmpA在其對宿主細(xì)胞的毒性中發(fā)揮著重要作用，但到目前對OmpA的研究和認(rèn)識僅僅局限在其對宿主細(xì)胞的凋亡作用，而OmpA侵襲宿主導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的同時是否還涉及其他信號分子我們還不清楚，因此本研究以免疫學(xué)中經(jīng)典的RAW264.7細(xì)胞為研究對象，分析了OmpA對其自噬及相關(guān)信號通路的影響。

鮑曼不動桿菌OmpA可以引起RAW264.7細(xì)胞LC3B-II表達(dá)水平增高，LC3B-II是自噬體形成的標(biāo)志蛋白，其表達(dá)強度越高說明自噬水平越強[15]，這與我們先前在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)OmpA所得到的結(jié)果相似，但OmpA是激活了哪條信號通路引起自噬的還不清楚。現(xiàn)在已知Akt/mTOR/p70S6K信號通路是調(diào)節(jié)自噬激活的關(guān)鍵分子，自噬發(fā)生時mTOR的活性會受到上游分子Akt的抑制，其磷酸化水平會降低；而p70S6K是mTOR下游的效應(yīng)蛋白，mTOR磷酸化降低時其磷酸化水平也會相應(yīng)降低；相反這些分子的磷酸化升高會抑制自噬[16-17]。我們發(fā)現(xiàn)OmpA引起RAW264.7細(xì)胞LC3B-II表達(dá)升高的同時還明顯抑制了Akt、mTOR和p70S6K磷酸化水平；而且自噬激活劑rapamycin可以進(jìn)一步抑制mTOR和p70S6K磷酸化水平并提高OmpA引起的LC3B-II表達(dá)，這提示OmpA可能是通過下調(diào)Akt/mTOR/p70S6K磷酸化水平來激活自噬的。

Figure 2.OmpA induced autophagy in RAW264.7 cells through Akt/mTOR/p70S6K signaling pathway. A: the phosphorylation levels of Akt, mTOR and p70S6K in the RAW264.7 cells treated with 10 mg/L OmpA for 0 h, 6 h, 12 h and 24 h were detected by Western blot; B: RAW264.7 cells were stimulated with 0, 5 and 10 mg/L OmpA for 24 h, and the protein levels of p-Akt, p-mTOR and p-p70S6K were detected by Western blot analysis; C: the RAW264.7 cells were treated with 400 nmol/L rapamycin (Rapa) for 6 h before co-stimulaton with 10 mg/L OmpA for 24 h, and Western blot was used to detect the protein levels of LC3B-II, p-mTOR and p-p70S6K. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, ** P<0.01 vs control group (0 h or 0 mg/L); ##P<0.01 vs OmpA group.

本研究證實鮑曼不動桿菌OmpA通過Akt/mTOR/p70S6K信號通路導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞自噬，這為將來進(jìn)一步研究鮑曼不動桿菌引起自噬的分子機制及找到對抗其感染的新方法提供理論依據(jù)。