抑制外泌體釋放對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響*

郭貴顯， 成傳訪▲， 顧杰蕾， 周文怡， 湯曉燕， 鐘 赟, 陳顏芳, 2， 劉世明△

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科， 廣州心血管疾病研究所， 廣東 廣州 510260； 2萊特州立大學(xué)Boonshoft醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與毒理學(xué)系， 美國 俄亥俄州 代頓 45435)

缺血性心臟病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。由于心臟內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制有限，心肌缺血梗死后引起心肌細(xì)胞的永久性缺失，導(dǎo)致局部纖維瘢痕的形成，從而導(dǎo)致左室重構(gòu)，最終引起心力衰竭。對(duì)于缺血性心臟病的治療現(xiàn)階段主要有藥物治療、介入治療及手術(shù)治療，但這些方法都有一定的局限性，使治療效果不能令人十分滿意。近年興起的細(xì)胞移植新方法對(duì)未來治療心血管疾病具有重要的應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)已有多種細(xì)胞尤其是干細(xì)胞用于治療心肌梗死的研究，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為細(xì)胞移植治療的種子細(xì)胞，具有取材方便、免疫原性低、不受倫理學(xué)限制、容易進(jìn)行自體移植等諸多優(yōu)點(diǎn)[1]。

移植的間充質(zhì)干細(xì)胞到達(dá)心肌梗死部位后在局部產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，除了增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及少量分化為心肌樣細(xì)胞外，還能通過旁分泌的方式產(chǎn)生大量的促血管生成因子等保護(hù)性細(xì)胞因子，改善缺血心肌的血液供應(yīng)或心肌代謝，以此來參與心臟組織的重建，從而改善心肌梗死后心功能[2]。盡管如此，移植的間充質(zhì)干細(xì)胞在缺血微環(huán)境中的存活率限制了干細(xì)胞的治療效果，近年來間充質(zhì)干細(xì)胞到達(dá)心肌缺血部位后釋放到大量具有心肌保護(hù)效應(yīng)的外泌體備受關(guān)注[3]。

外泌體是一種納米級(jí)的小囊泡，其能攜帶大量生物學(xué)信號(hào)并參與細(xì)胞間的生物信息交流，外泌體從細(xì)胞內(nèi)釋放到胞外的過程主要由一些小G蛋白協(xié)助完成，其中Rab27a是調(diào)節(jié)外泌體釋放的重要因子之一，其主要功能是將多囊泡體運(yùn)載至細(xì)胞膜相應(yīng)部位，使得多囊體與細(xì)胞膜融合而釋放外泌體[4]。移植的間充質(zhì)干細(xì)胞在心梗部位釋放大量的外泌體從而發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)[5]，但目前對(duì)于外泌體缺失對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響尚未有詳細(xì)的報(bào)道。因此本文通過敲除Rab27a來抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)外泌體的釋放，隨后對(duì)抑制外泌體釋放的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力及缺氧耐受能力做初步的研究。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，雌雄不限，6～8周齡，18～20 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2013-0002。BM-MSCs由小鼠股骨及脛骨中分離提取。

2 主要試劑

IMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；外泌體提取試劑盒購自Invitrogen；EdU試劑盒(Cell-LightTMEdU Apollo 567 In Vitro Kit)購自廣州銳博生物科技有限公司；MTS購自Promega；抗Rab27a抗體(SC-22756)購自Santa Cruz；抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(CST 2586S)及抗GADPH抗體(CST 2118L)購自CST；抗CD63抗體(ab8219)購自Abcam；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。

3 主要方法

3.1TALEN技術(shù)構(gòu)建Rab27a基因敲除模型 根據(jù)NCBI上Rab27a基因的序列，利用TALEN(transcription activator-like effector nucleases)在線設(shè)計(jì)工具(http://zifit.Partners.org/ZiFiT/Choice Menu.aspx)設(shè)計(jì)基因敲除位點(diǎn)，并構(gòu)建相關(guān)載體，隨后將Rab27a的TALEN-L mRNA 和 TALEN-R mRNA 混合在一起后以第2個(gè)外顯子作為靶點(diǎn)在顯微鏡下利用顯微操作系統(tǒng)注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，隨后移植到ICR受體雌鼠體內(nèi)，具體實(shí)驗(yàn)方法參考小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[6]。該過程與賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司共同完成。隨后取3周齡小鼠鼠尾用堿裂解法提取基因組 DNA并檢測(cè)其基因序列(上游測(cè)序引物Rab27a-F的序列為5’-ACCAGCTCTAATTCTCGATTCCTGG-3’,下游測(cè)序引物Rab27a-R的序列為5’-GGCTTCTCAAGTCCGGTTAATTTGT-3’)，按照活性鑒定方法對(duì) F0 代小鼠進(jìn)行鑒定，以此來挑選敲除Rab27a的純合子小鼠。

3.2間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 按照全骨髓法提取間充質(zhì)干細(xì)胞[7]。取敲除Rab27a的純合子小鼠(knockout, KO)及野生型(wild-type,WT)小鼠兩側(cè)股骨及脛骨，去除兩端用1 mL注射器沖出骨髓腔內(nèi)骨髓細(xì)胞，隨后1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，最終用含10% 胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，并接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。48 h后首次換液，并用PBS清洗2次，同時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度及形態(tài)。待細(xì)胞密度到達(dá)80%～90%后按1∶2傳代，傳至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),隨后取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)消化、重懸；取流式細(xì)胞儀專用試管4個(gè)，每管加入100 μL細(xì)胞懸液，加入小鼠抗人Sca-1 APC-A、CD34 PE-A、CD44 FITC-A和CD45 PE-Cy7-A熒光單克隆抗體各5 μL，4 ℃孵育15 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。

3.3外泌體的提取及鑒定 KO-MSCs和WT-MSCs分別用0.25%的胰酶消化后用IMDM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸至1×1010/L，并接種在6孔板中，培養(yǎng)2 d后，棄培養(yǎng)基換用2 mL去除外泌體的10%胎牛血清的IMDM 培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后收集上清，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min后加入1 mL結(jié)晶紫染色液， 15 min后在顯微鏡下拍照并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)基于4 ℃、2 000×g離心30 min以去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片。收集上清液加入1 mL外泌體提取試劑，渦旋混勻后4 ℃孵育過夜，之后于4 ℃、10 000×g離心1 h。棄上清，用100 μL去外泌體的PBS重懸，利用納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis， NTA)對(duì)外泌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)將20 μL外泌體混勻滴于銅網(wǎng)表面，室溫靜置1 min，用濾紙吸干液體；滴加適量磷鎢酸室溫復(fù)染5 min，用濾紙從側(cè)面小心吸干復(fù)染液后置于電鏡下觀察外泌體大小和形態(tài);最后通過Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白CD63的表達(dá)。

3.4MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 KO-MSCs和WT-MSCs分別用0.25%的胰酶消化后，用IMDM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，以1×106cells/L的密度接種至96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2 d后加入100 μL含不同濃度(0、25、50、100、200和400 μmol/L)H2O2培養(yǎng)基培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液加入100 μL含有20 μL MTS的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中避光孵育3 h后在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm時(shí)各孔的吸光度(A)值。

3.5TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 KO-MSCs及WT-MSCs分別消化后重懸，以1×106cells/L的密度接種至96孔板中，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2 d后棄培養(yǎng)基每孔加入含有100 μmol/L H2O2的IMDM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育6 h，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清并用PBS清洗2遍，用4%多聚甲醛室溫固定25 min，PBS清洗2～3遍后用100 μL 0.5% Triton X-100室溫靜置5 min，棄通透液加入100 μL平衡緩沖液室溫靜置5～10 min。棄平衡液后加入50 μL rTdT，37 ℃避光孵育60 min，棄孵育buffer并每孔加入100 μL 2×SSC溶液，室溫孵育5 min，棄孵育buffer并用PBS清洗2～3次，隨后加入DAPI染液，室溫孵育15～20 min，棄染色液用PBS清洗2～3遍后在倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

3.6EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 采用上述相同的方法將KO-MSCs和WT-MSCs分別接種在96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2 d后每孔加入含50 μmol/L EdU培養(yǎng)基共孵育4 h，用PBS清洗細(xì)胞2次后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。棄固定液PBS清洗細(xì)胞2次，加入100 μL 2 g/L的甘氨酸中和殘留多聚甲醛，棄甘氨酸后PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入100 μL 0.5% Triton X-100(PBS配制)孵育10 min，PBS清洗細(xì)胞2次后加入Apollo染色液避光室溫孵育30 min，棄染色液后加入0.5% Triton X-100清洗2～3次，加入無水甲醇清洗2次以此來降低染料背景，PBS清洗細(xì)胞2次后每孔加入100 μL 1×Hoechst 33342工作液室溫避光孵育30 min，PBS清洗細(xì)胞2次后倒置熒光顯微鏡觀察拍照。隨后通過Western blot檢測(cè)MSCs中PCNA的表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所用正態(tài)分布統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Rab27a基因敲除小鼠的建立

本研究利用TALEN技術(shù)在小鼠Rab27a基因中第2個(gè)外顯子上敲除7個(gè)堿基。Rab27a在細(xì)胞內(nèi)囊泡的運(yùn)輸起著重要的作用，Rab27a基因敲除小鼠由于毛囊根部的黑色素小體釋放障礙而導(dǎo)致其毛發(fā)呈現(xiàn)灰白色,見圖 1A；隨后經(jīng)過基因測(cè)序可以看到相對(duì)于野生型小鼠，Rab27a基因敲除小鼠存在7個(gè)堿基的缺失,見圖1B；同時(shí)Rab27a蛋白表達(dá)也明顯降低，見圖1C，說明利用TELEN技術(shù)成功構(gòu)建Rab27a基因敲除小鼠。

2 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面表達(dá)特異性抗原Sca-1和CD44，而不表達(dá)造血干細(xì)胞表面特異性抗原CD34和CD45。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物Sca-1表達(dá)率為95.60%±1.06%，CD44表達(dá)率為96.09%±1.79%，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性；CD34表達(dá)率為0.54%±0.16%, CD45表達(dá)率為0.55%±0.17%，呈現(xiàn)陰性，見圖2。

3 外泌體釋放的數(shù)量及鑒定

利用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)來計(jì)數(shù)KO-MSCs和WT-MSCs的數(shù)量,見圖3A；同時(shí)利用外泌體提取試劑盒提取MSCs釋放的外泌體并用NTA計(jì)數(shù)外泌體的數(shù)量，見圖3B；以此來計(jì)算單個(gè)MSCs釋放的外泌體的數(shù)量，見圖3C；利用透射電鏡來觀察外泌體的形態(tài)及大小，見圖3D；同時(shí)也檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白CD63的表達(dá)[8]，見圖3E。由上述數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，相比于WT-MSCs，KO-MSCs釋放的外泌體明顯減少。

4 外泌體釋放缺陷引起MSCs增殖能力降低

EdU實(shí)驗(yàn)顯示在熒光顯微鏡下增殖期的MSCs發(fā)紅色熒光，用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算紅色熒光及綠色熒光的數(shù)量，并經(jīng)過SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)可知，KO- MSCs的增殖能力顯著低于WT-MSCs,見圖4A。同時(shí)用Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組MSCs中PCNA的表達(dá)量，可發(fā)現(xiàn)相比于WT-MSCs，KO-MSCs中PCNA的表達(dá)明顯下調(diào),見圖4B。

Figure 1.Establishment of Rab27a knockout (KO) mice. A: the representative wild-type (WT) and KO mice; B: validation of Rab27a depletion in BM-MSCs by DNA sequencing; C: the expression of Rab27a was significantly reduced in the BM-MSCs of the KO mice. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs WT-MSCs.

Figure 2.Surface marker determination of bone marrow mesenchymal stem cells. Mean±SEM. n=3.

Figure 3.The quantity and identification of the exosomes. A: crystal violet staining of BM-MSCs (×200); B: the exosomes released from WT-MSCs and Rab27a KO-MSCs were quantified by NTA; C: the relative amount of exosomes released from a single MSCs; D: isolated exosomes were confirmed by transmission electron microscopy; E: the protein expression of CD63 was detected by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs WT-MSCs.

Figure 4.The proliferation ability of KO-MSCs and WT-MSCs. A: EdU assay of BM-MSCs; B: the protein expression of PCNA was determined by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs WT-MSCs.

5 外泌體釋放缺陷引起MSCs對(duì)缺氧的耐受能力降低

利用MTS實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)經(jīng)H2O2處理的間充質(zhì)干細(xì)胞的活力，發(fā)現(xiàn)KO-MSCs對(duì)缺氧的耐受能力明顯低于WT-MSCs,見圖5A；同時(shí)用TUNEL實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)KO-MSCs對(duì)缺氧的耐受能力明顯降低，見圖5B。

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體用于心肌梗死的治療在近來的研究中備受關(guān)注，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體因攜帶有其宿主細(xì)胞的生物學(xué)信息而在心肌梗死中發(fā)揮心肌保護(hù)作用，所以干細(xì)胞分泌的外泌體將作為以后治療心肌梗死的一種重要的工具[9]，然而移植的間充質(zhì)干細(xì)胞趨化至心肌梗死部位的存活率限制了干細(xì)胞的治療效果，所以趨化至心肌梗死部位的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受能力及增殖能力尤為重要。當(dāng)前研究卻很少關(guān)注外泌體的釋放對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞本身發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的影響，本文就簡(jiǎn)約地闡述抑制間充質(zhì)干細(xì)胞釋放外泌體可導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力及對(duì)缺氧的耐受能力降低。

Figure 5.Defects in exosome release resulted in reduction of hypoxia tolerance. A: compare with WT-MSCs, the viability of KO-MSCs was significantly decreased after H2O2 treatment; B: TUNEL staining was used to assess the level of apoptosis (blue: DAPI; green: TUNEL; ×40). Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs WT-MSCs.

細(xì)胞通過內(nèi)吞作用在胞內(nèi)形成多囊泡體，在外界刺激時(shí)，Rab27a引導(dǎo)多囊泡體靶向移動(dòng)至胞膜脂質(zhì)筏，并與多囊泡體的效應(yīng)蛋白(突觸結(jié)合蛋白4家族蛋白)結(jié)合致使多囊泡體與細(xì)胞膜相互融合并向胞外分泌外泌體[10]。本文運(yùn)用TELAN技術(shù)靶向敲除C57BL/6J小鼠Rab27a基因[11]，并且從Rab27a基因敲除小鼠的骨髓中提取間充質(zhì)干細(xì)胞，用外泌體試劑盒提取間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的外泌體，同時(shí)用NTA檢測(cè)外泌體的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示Rab27a敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌外泌體的量明顯減少。隨后我們探索抑制外泌體的釋放是否對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。通過EdU實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于WT-MSCs的增殖能力，KO-MSCs的增殖能力明顯降低。眾所周知，間充質(zhì)干細(xì)胞具有增殖及分化潛能并在一定條件下可以分化成多種功能細(xì)胞，以此在治療心肌梗死方面提供更為廣闊的應(yīng)用前景。抑制間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的釋放而引起間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力降低最終導(dǎo)致MSCs到達(dá)心肌缺血部位后發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)的能力明顯降低。隨后我們還發(fā)現(xiàn)抑制間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的釋放導(dǎo)致其缺氧耐受能力明顯下降。有研究表明體外移植的間充質(zhì)干細(xì)胞趨化至心肌梗死部位后在缺氧的環(huán)境下存活率低，同時(shí)受損的心肌細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)MSCs的凋亡，以此限制MSCs治療療效。目前尚不清楚抑制MSCs分泌外泌體后是否對(duì)其本身的缺氧耐受能力產(chǎn)生影響。通過我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KO-MSCs的缺氧耐受能力明顯低于WT-MSCs。外泌體在最早發(fā)現(xiàn)時(shí)認(rèn)為是轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞廢物的囊泡，在隨后的研究發(fā)現(xiàn)外泌體還可以攜帶宿主細(xì)胞的生物學(xué)信號(hào)[10]。近期有研究表明外泌體可以將受損的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，但是當(dāng)抑制外泌體的分泌而導(dǎo)致受損的DNA 在細(xì)胞內(nèi)大量堆積可引起機(jī)體的內(nèi)源免疫反應(yīng)，并激活了活性氧依賴的DNA損傷，這樣導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯甚至引起細(xì)胞凋亡[12]；我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌的外泌體減少，可導(dǎo)致細(xì)胞之間的信息交流減少，最終影響細(xì)胞的增殖和自噬?？偟膩碚f，細(xì)胞釋放外泌體減少，導(dǎo)致細(xì)胞的內(nèi)外環(huán)境紊亂，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理功能。

綜上所述，本研究采用TALEN技術(shù)，建立Rab27a敲除的細(xì)胞模型，從而抑制間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的釋放，導(dǎo)致其增殖能力及缺氧耐受能力明顯降低。