CD3+、CD4+和CD8+ T細胞Vβ亞家族中PD-1免疫表型檢測方法的建立*

陳少華, 黃靜穎， 譚家雄， 陳友純， 鐘 雋， 盧育洪， 郁 志， 李揚秋,

(暨南大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所， 2附屬第一醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510632)

程序性細胞死亡蛋白1(progammed cell death protein 1，PD-1; 又稱CD279)是CD28家族成員的一種免疫球蛋白家族I型跨膜蛋白，參與了程序性細胞死亡過程[1-2]。正常情況下，PD-1與其配體PD-L1(又稱CD274)結(jié)合從而抑制活化T細胞的功能，維持外周T細胞對自身抗原的免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。PD-1主要表達于活化的T細胞表面，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在多種實體瘤T細胞中過表達，同時與高表達于腫瘤細胞表面的配體結(jié)合，能抑制T細胞的功能從而促進腫瘤免疫逃逸機制。而在血液腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了PD-1高表達，多數(shù)研究認為其主要表達于CD8+T細胞上，導(dǎo)致CD8+T細胞的耗竭和失能[3-5]。由于不同的T細胞譜系行使功能有所不同，為了更好地確定PD-1在T細胞譜系中的分布，我們采用流式細胞技術(shù)，建立PD-1在CD3+、CD4+和CD8+T細胞受體(T-cell receptor，TCR)Vβ 24個亞家族中的分布特點的檢測方法，為進一步了解白血病和腫瘤病人等免疫抑制狀態(tài)提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 樣本資料

本研究收集了10例健康成人志愿者外周血，男性6例，女性4例，中位年齡26歲，樣本來自本研究所健康獻血者，樣本的采取已告知志愿者，并通過醫(yī)院倫理委員會批準。

2 外周血單個核細胞(periphral blood mononu-clear cells, PBMC)提取

EDTA抗凝管采集受試者外周靜脈血4～8 mL，利用人外周血淋巴細胞分離液(Ficoll配制)密度梯度離心分離PBMC，用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞備用。

3 流式細胞術(shù)檢測

3.1單細胞懸液的制備 準備9只干燥流式管，分別標注為同型管-ISO及A～H。將1×106個PBMC加入每只管中，制成單細胞懸液。

3.2抗體混懸液的配制

3.2.1同型抗體混懸液 1.5 mL 離心管中加入20 μL細胞染色緩沖液后，根據(jù)抗體說明書分別加入推薦劑量的CD45、CD3、CD4、CD8抗體和PE-Cy7-isotype control，充分混勻備用。

3.2.2全染抗體混懸液 1.5 mL 離心管中加入20 μL 細胞染色緩沖液后，根據(jù)抗體說明書分別加入推薦劑量的CD45-APC、CD3-Alexa Fluor?700、CD4-eFluor? 450、CD8-Percp-Cy5.5和PD-1-PE-Cy7，充分混勻備用。

3.3流式細胞術(shù)上機前準備 分別將同型抗體混懸液和全染抗體混懸液分別加入同型管-ISO和A～H流式管，充分混勻；按照IOTest? Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit (Beckmann Coulter; 該試劑盒一共8管,共包含24個TCR Vβ亞家族，每一管均為FITC和PE偶聯(lián)的復(fù)合抗體,標為A～H，每一管復(fù)合抗體包含3個TCR Vβ亞家族的抗體)說明書，同型流式管不加任何TCR Vβ偶聯(lián)的流式抗體，A～H管依次加入推薦劑量的流式抗體，充分混勻，室溫避光孵育15～20 min。加入2～3 mL細胞染色緩沖液，重懸細胞，300×g轉(zhuǎn)速下離心5 min后去除上清液。加入300～500 μL 細胞染色緩沖液重懸細胞，待上機。

3.4流式細胞術(shù)分析 采用BD FACSVerse流式細胞儀(BD Biosciences)進行上樣檢測，先使用未經(jīng)染色的血細胞懸液調(diào)整儀器電壓后，分別使用FITC、APC-H7、Percp-Cy5.5、BV510、PE-Cy7、Alexa Fluor?647、PE和Pacific Blue單陽管，調(diào)整各熒光之間的熒光補償。至少收集100 000個CD3+細胞進行分析，收集后的原始數(shù)據(jù)采用FlowJo軟件(Becton，Dickinson and Company)進行分析。TCR Vβ亞家族流式檢測結(jié)果參考IOTest? Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit所提供的正常人TCR Vβ亞家族分布頻率數(shù)據(jù)(Quick Reference Card數(shù)據(jù))。

結(jié) 果

在健康成人的檢測中，CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞亞群中檢測的24個TCR Vβ亞家族總和，符合試劑盒所提供的Quick Reference Card數(shù)據(jù)。10例健康成人在CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞中的分布情況見圖1，健康成人在CD3+T細胞中主要優(yōu)勢利用Vβ2、Vβ3、Vβ8、Vβ9、Vβ5.1、Vβ13.1和Vβ13.2；而在CD3+CD4+T細胞中的優(yōu)勢利用主要集中在Vβ2、Vβ3、 Vβ8、Vβ9、Vβ5.1和Vβ13.1等亞家族；在CD3+CD8+T細胞中的優(yōu)勢利用則在Vβ1、Vβ2、Vβ3、Vβ9、Vβ13.1和Vβ13.2等亞家族中。

Figure 1.The distribution pattern of 24 TCR Vβ repertoires in T-cell subsets of peripheral blood from healthy individuals.

由于24個Vβ亞家族抗體共有8管，每一管均為FITC和PE偶聯(lián)的復(fù)合抗體(A～H)，每一管復(fù)合抗體包含3個TCR Vβ亞家族的抗體，如圖2所示，通過優(yōu)化后均可獲得界限清晰的細胞群，因此，進一步分析顯示，PD1+細胞在健康成人CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的24個TCR Vβ亞家族中均可以檢測到，PD-1+細胞在T細胞各亞群中分布頻率雖有個體差異，但相對比較均衡，在CD4+T細胞中，PD-1+細胞在Vβ5.2+T細胞中的分布頻率較高，而在CD8+T細胞中，PD-1+細胞在Vβ11+和Vβ13.6+T細胞中的分布頻率較高，見圖3。

討 論

近年來免疫抑制性受體PD-1的研究越來越受到重視，主要是其在腫瘤靶向治療中開辟了新方向，為腫瘤靶向免疫治療帶來了新希望[6-7]。目前PD-1 的研究主要集中在實體瘤，而在血液惡性腫瘤中，免疫抑制性受體在T細胞免疫方面的研究較少。PD-1在T細胞亞群中的過表達嚴重影響病人的T細胞免疫狀態(tài)，導(dǎo)致T細胞無法行使正常的功能，PD-1可表達于抗腫瘤特異性CD8+T細胞上，與腫瘤細胞上的相應(yīng)配體結(jié)合形成的負性共刺激效應(yīng)，在體內(nèi)發(fā)揮限制、終止或減弱T細胞的應(yīng)答作用[3-5]，是形成T細胞免疫耐受的重要原因。由于這些負性共刺激分子參與腫瘤免疫應(yīng)答，使得免疫調(diào)控和免疫治療策略更為復(fù)雜。目前多數(shù)研究采用流式細胞術(shù)檢測PD-1在T細胞亞群CD4+和CD8+T細胞中的表達和分布情況，而尚未涉及其在CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞亞群下TCR Vβ各亞家族中的分布，而不同的TCR亞家族T細胞其識別不同的抗原表位，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)某些TCR亞家族T細胞的克隆性擴增如Vβ21+T細胞與抗白血病作用密切相關(guān)[8-9]。因此本研究結(jié)合多年在TCR基因譜系研究的基礎(chǔ)上擬建立免疫抑制性受體PD-1在TCR Vβ各亞家族中的檢測方法，希望將其應(yīng)用于了解白血病病人外周血T細胞譜系中PD-1表型細胞分布頻率特點的研究。

Figure 2.Gating strategy for PD-1+ TCR Vβ1～3+ CD4+ /CD8+ T cells from one case of healthy individual by flow cytometry.

Figure 3.The distribution frequency of PD-1+ cells in CD3+, CD4+ and CD8+ TCR Vβ repertoire T cells in peripheral blood from healthy individuals.

我們首先利用健康成人外周血進行檢測，確定TCR Vβ亞家族在T細胞各亞群中的檢測是否正確，檢測結(jié)果顯示完全符合試劑盒所提供的Quick Reference Card數(shù)據(jù)，所有樣本均可以檢測到24個Vβ亞家族，這與既往我們通過RT-PCR和基因掃描所發(fā)現(xiàn)的Vβ亞家族的分布特點相似，而且健康成人在CD3+、CD4+和CD8+T細胞中主要優(yōu)勢利用的Vβ亞家族如Vβ2和Vβ5.1等均為高頻表達的亞家族[10]，而通過流式檢測我們還發(fā)現(xiàn)了其它高頻表達的亞家族，如Vβ3、Vβ8、Vβ9、Vβ13.1和Vβ13.2亞家族。故此，我們從細胞表型的層面上建立了Vβ亞家族的分析方法，目的在于進一步檢測這些細胞亞群表面所表達的其他受體的情況。我們近期研究顯示急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)病人外周血T細胞中PD-1+T細胞比例明顯升高[5]，為此，我們通過該研究方法，同時檢測PD-1在TCR Vβ各亞家族中的分布頻率，檢測結(jié)果表明所有亞家族均可以檢測到PD-1+T細胞，提示該方法的敏感性達到基本要求。同時，我們也初步發(fā)現(xiàn)了不同Vβ亞家族中PD-1+T細胞的比例有所差異，如PD-1+細胞在CD3+Vβ11+和Vβ14+T 細胞中的分布頻率較高，而在CD4+和CD8+T細胞中，則分別在Vβ5.2+和Vβ11+、Vβ13.6+T細胞中分布頻率較高，但總體的分布還是比較均衡。這可能是PD-1在健康成人中的一種特征性表現(xiàn)，但由于樣本量較少，還有待擴大樣本量進一步深入探討。同時，我們也初步利用所建立的檢測方法應(yīng)用于AML病人外周血T細胞的檢測，結(jié)果顯示AML病人CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞24個TCR Vβ亞家族的優(yōu)勢利用和健康成人的有所不同(結(jié)果未報道)。

在方法建立過程中，我們同時對比了利用全血或PBMC檢測各Vβ亞家族的分布和PD-1+T細胞比例，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果相似，由于TCRVβ亞家族有24個之多，檢測需要的細胞數(shù)量較大，同時考慮到血液腫瘤病人外周血收集比較困難，病人淋巴細胞數(shù)差異較大等原因，我們最后采用了PBMC進行檢測，其優(yōu)點就是細胞數(shù)明確，可以確保實驗的順利進行，同時也避免由于全血中的某些成分如血漿或血小板等影響抗體的偶聯(lián)。

總之，本項工作成功建立了多色熒光流式細胞術(shù)檢測CD3+、CD4+和CD8+T細胞TCR Vβ亞家族中免疫抑制性受體PD-1分子免疫表型方法，初步探討其在健康人T細胞亞群TCR Vβ亞家族中的表型分布頻率特點，由于本研究仍在繼續(xù)中，尚有待擴大樣本量，同時將該方法運用于血液腫瘤病人的檢測，為進一步研究病人T細胞免疫抑制特點提供更全面的認識。