大豆胰蛋白酶抑制劑的異源表達與生化特性解析

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(1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457; 2.天津科技大學化工與材料學院生物化工系,天津 300457)

絲氨酸蛋白酶抑制劑是通過與絲氨酸蛋白酶形成復合物使其部分或完全失活的一類物質(zhì)的總稱,它普遍存在于動物、植物和微生物中[1]。根據(jù)氨基酸排列順序、拓撲學性質(zhì)及結(jié)合機制的不同,可以將其分為16個家族,已從植物中發(fā)現(xiàn)了7個家族[2]。其中,大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean trypsin inhibitiors,STIs)是豆科植物中起主要作用的絲氨酸蛋白酶抑制劑,包括已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Kunitz類抑制劑(KTI)和Bowman-Birk類抑制劑(BBT)兩種類型[3-4]。因其具有調(diào)理內(nèi)源蛋白酶活性、貯藏蛋白、抗蟲以及抗病原菌等生理功能,胰蛋白酶抑制劑在食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應用價值[3,5]。

目前,多肽類胰蛋白酶抑制劑的制備方法主要從組織或種子中分離純化。分離純化過程需經(jīng)過水浸、堿提取、分步鹽析、離子交換層析和凝膠過濾層析等程序,過程繁瑣,耗時長,且產(chǎn)率和純度較低[6];實驗室進行小量純化時有報道采用溴化氰活化的瓊脂糖凝膠進行親和層析,但其價格昂貴[6]。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展,異源表達成為獲得胰蛋白酶抑制劑的一條可行途徑。

大豆基因組中至少存在10個不同的sti基因[7],其中ksti3基因已經(jīng)在大豆和杜氏鹽藻中進行了克隆表達[2-3,7-8]。本課題組前期通過對大豆基因組中的胰蛋白酶抑制劑基因進行比對和分析,發(fā)現(xiàn)了一個新的編碼基因sti[7],其理化特性及生理功能等尚未報道。為此,本研究借助于分子克隆技術(shù)將其在畢赤酵母中進行了異源表達,經(jīng)初步純化后,對其生化特征進行了解析,以期替代現(xiàn)有的胰蛋白酶制備方法,并為其實際應用提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌JM109、畢赤酵母菌GS115 由本實驗室保藏;含有胰酶抑制劑基因sti的重組畢赤酵母菌GS115(pPIC-STI) 由本研究中構(gòu)建、篩選并保存;畢赤酵母及其重組菌的培養(yǎng)方法(YPD、BMGY以及BMMY等培養(yǎng)基) 按照Invitrogen的畢赤酵母操作手冊進行;大腸桿菌 采用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng);質(zhì)粒小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、GeneRuler 1 kb DNA Ladder和生物素等 寶生物工程(大連)有限公司;蛋白分子量標準、遺傳霉素(G418)、無氨基酵母氮源(YNB)和氨芐青霉素等 Invitrogen公司;酵母抽提物和胰蛋白胨等 英國OXOID公司;HiTrap Q陰離子交換柱 美國GE Healthcare公司;BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;牛胰蛋白酶、苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺(L-BAPA)以及其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

PTC-200型PCR基因擴增儀 美國MJ Research Inc.;Alpha-EC凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司;電轉(zhuǎn)儀 美國BTX公司;LZDX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SP-2012UV型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆胰酶抑制劑的克隆表達與分離純化

1.2.1.1 重組菌的構(gòu)建 質(zhì)粒提取、PCR及其產(chǎn)物的純化、限制性酶酶切、連接、化學轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選等操作均采用實驗室常規(guī)方法[9]。其中,目的基因由生工生物工程(上海)股份有限公司按畢赤酵母的密碼子偏愛性進行優(yōu)化并合成,引物(STI-1:5′-GTACAATTTGTTTTGGATACTGATGATGATC-3′;STI-2:5′-TGCTCTAGACTAAGCAGTGGAAGATCT GAACTTTTG-3′,下劃線部分為人工引入的限制性酶切位點)是根據(jù)優(yōu)化后的基因序列進行設(shè)計,并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。最后將獲正確的陽性轉(zhuǎn)化子保菌,并命名為GS115(pPIC-STI)。

1.2.1.2 抑制劑STI的發(fā)酵制備 將畢赤酵母重組菌GS115(pPIC-STI)的單菌落接種于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中進行活化,于220 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)(18～20) h至對數(shù)生長期(OD600=2.0～6.0)。然后按1%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)入50 mL BMGY培養(yǎng)基中,在相同條件下培養(yǎng)(18～20) h后,離心(4 ℃,8000 r/min,5 min)收集菌體。再用50 mL BMMY培養(yǎng)基重懸細胞至OD600值為1.0,220 r/min、30 ℃繼續(xù)培養(yǎng),每隔24 h補加甲醇使其終濃度為0.5%(v/v)進行誘導。與此同時,取樣進行抑制活性檢測,直到抑制活性不再增加為止(大約5 d)。發(fā)酵結(jié)束后,于4 ℃、8000 r/min離心10 min收集上清液,即為蛋白酶抑制劑的發(fā)酵液,-20 ℃保存或者凍干備用。

1.2.1.3 抑制劑STI的分離純化 將上述發(fā)酵液用30%～80%的硫酸銨分級沉淀后,再用截留分子量為14 kU的透析袋進行透析,然后通過HiTrap Q陰離子柱對其進行純化,并采用pH為5.75的洗脫液(STI的理論等電點pI為4.75)對其進行梯度洗脫,收集洗脫峰,最后,測定抑制劑的抑制活性,并通過SDS-PAGE(濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和15%)[10]分析蛋白的純化情況。此外,蛋白濃度的測定采用BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒進行。

1.2.2 抑制劑STI的生化特性分析

1.2.2.1 STI抑制活性的測定 參考Erlanger等[11]的方法,以L-BAPA為底物檢測抑制劑的抑制活性。具體操作流程如下:

樣品組:吸取0.1 mL胰蛋白酶溶液(0.027%,w/v),與0.1 mL胰蛋白酶抑制劑溶液(0.025%,w/v)混合均勻后,于37 ℃水浴鍋中放置10 min,使胰蛋白酶抑制劑與胰蛋白酶充分結(jié)合形成復合物,降低或消除胰蛋白酶的水解活性。

對照組:將0.1 mL胰蛋白酶溶液(0.027%,w/v)與1 mL 5.3 mol/L的三氯乙酸溶液混勻,于37 ℃孵育10 min。然后取2 mL L-BAPA溶液(0.06%,w/v),分別加入上述兩組混合液中,充分混勻。37 ℃恒溫水浴10 min后,迅速放在冰上冷卻,然后樣品組加入1 mL三氯乙酸溶液終止反應,對照組補加0.1 mL胰蛋白酶抑制劑溶液(0.025%,w/v),并在410 nm下測定其吸光值。胰酶酶活的測定與抑制劑活性的檢測方法相近,只是將胰酶抑制劑用0.1 mL的緩沖液代替。以每分鐘410 nm處的吸光值增加0.01,為一個胰蛋白酶活力單位(AU)。

胰蛋白酶抑制劑的抑制率(TIR)為添加抑制劑后，胰蛋白酶殘余酶活性與未添加抑制劑時胰酶酶活性的比值。而胰蛋白酶抑制劑的抑制活性=AU×TIR。

1.2.2.2 STI熱穩(wěn)定性的測定 將重組抑制劑STI用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH為8.2,內(nèi)含0.02 mol/L CaCl2)進行稀釋,使其終濃度為0.025%(w/v)。然后將其分別置于溫度為40、50、60、70、80、90和100 ℃的水浴鍋中,孵育1 h后,冷卻至室溫。以L-BAPA為底物,按照1.2.2.1的方法測定STI的剩余抑制活性,每個樣品重復測定3次。以最高抑制活性為100%,計算出其它溫度下的相對抑制活性,然后作出STI的相對抑制活性與溫度之間關(guān)系的曲線圖。

1.2.2.3 STI的pH穩(wěn)定性測定 分別將STI溶解于pH為2.0～11.0的緩沖液中,使其終濃度為0.025%(w/v)。室溫下孵育1 h后,調(diào)節(jié)其pH至8.0,測定STI的剩余抑制活性。以最高抑制活性為100%,計算出其它pH下的相對抑制活性,并作出STI相對抑制活性與pH的關(guān)系曲線圖。所用緩沖液為:50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)和50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0、10.0和11.0)。

1.2.2.4 金屬離子對STI活性的影響 在37 ℃和pH8.0的條件下,分別在反應體系中加入不同的金屬離子(Na+、K+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+和Fe3+),使其終濃度分別為1和5 mmol/L。然后按照1.2.2.1的方法來測定STI的抑制活性,以未加金屬離子的反應體系的抑制活性為100%,考察金屬離子對STI活性的影響。

1.2.2.6 STI抑制專一性的測定 分別用27 μg/mL的胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶替換胰蛋白酶,并將10 μg/mL的抑制劑STI加入反應體系中,其它條件均不變。然后按照1.2.2.1的方法,測定并比較抑制劑STI對不同蛋白酶的抑制效果,即可確定STI是否具有抑制專一性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)實驗均設(shè)置三個平行，采用軟件SPSS 19.0進行方差分析，Origin 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 STI的誘導表達與分離純化

通過搖瓶發(fā)酵制備蛋白酶抑制劑STI的發(fā)酵液。經(jīng)測定,發(fā)酵液中胰蛋白酶抑制劑的抑制活性達到39.06 TIU/mg,表達量約為30 mg/L。進一步通過鹽析、透析和離子交換層析將STI的發(fā)酵液進行了純化。純化后,抑制劑的比抑制活性提高了19.56倍,回收率為60.85%(表1)。其相對分子量約為20.0 kU,與其理論分子量(19.7 kU)相符。而且條帶單一,已達到電泳純(圖1),基本滿足生化特征分析的要求。

表1 STI的分離純化Table 1 Isolation and purification of STI

圖1 SDS-PAGE分析STI的純化情況Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purification of STI注:M:蛋白分子量標準;1:鹽析、透析后的STI;2:離子交換層析純化后的STI。

2.2 STI的熱穩(wěn)定性

STI熱穩(wěn)定性的測定結(jié)果如圖2所示。當溫度保持在40～80 ℃范圍內(nèi)時,STI的相對抑制活性維持在93%以上,具有較好的熱穩(wěn)定性;而當溫度高于80 ℃時,其相對抑制活性急劇下降;當溫度為90 ℃時,STI的相對抑制活性仍維持在55%?？梢娭亟MSTI具有很好的熱穩(wěn)定性。

圖2 STI的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of STI

2.3 STI的pH穩(wěn)定性

pH對STI抑制活性的影響如圖3所示。從圖中可以看出,隨著pH的升高,其抑制活性沒有明顯的改變。在pH2.0～11.0范圍內(nèi),STI的相對抑制活性均維持在85%以上,具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 STI的pH穩(wěn)定性Fig.3 pH stability of STI

2.4 金屬離子對STI抑制活性的影響

1 mmol/L和5 mmol/L不同的金屬離子對STI抑制活性的影響如圖4所示。K+、Zn2+和Mg2+對重組STI活性有明顯的激活作用,且5 mmol/L Mg2+的激活效果最明顯;而Cu2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+和Fe3+對其活性有強烈的抑制作用,其中5 mmol/L Mn2+對其抑制作用最強。Na+對STI的活性沒有明顯的影響。

圖4 金屬離子對STI抑制活性影響Fig.4 Effects of metal ions on the inhibitory activity of STI

2.5 STI抑制方式和抑制能力

圖5 胰蛋白酶活性-STI動力學的Lineweaver-Burk圖Fig.5 Lineweaver-Burk plots of trypsin activity-STI kinetics注:a,b和c分別添加0、4和8 μg/mL抑制劑。

2.6 STI的抑制專一性

STI對胰蛋白酶胰、凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或堿性蛋白酶的抑制率匯總于表2。由表可知,STI對胰蛋白酶的抑制作用最強,對胰凝乳蛋白酶有較弱的抑制作用;而對胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶未表現(xiàn)出抑制作用,從而確定了STI對胰蛋白酶有較強的抑制專一性。

表2 STI的抑制專一性Table 2 Inhibitory specificity of STI

3 討論

本文構(gòu)建的畢赤酵母重組菌GS115(pPIC-STI)的發(fā)酵上清液中雜蛋白較少,只需鹽析、透析和離子交換層析等相對簡單的純化過程即可得到電泳純的STI(圖1)。純化后,STI的比抑制活性達到了1043.02 TIU/mg(表1),遠高于即墨野生大豆胰酶抑制劑的比活力(672.06 U/mg)[12]、一步法和多步法獲得的大豆胰酶抑制劑的比活力(分別為65.58和433.33 U/mg)[13]等。然而,重組菌表達STI的表達量還不夠高(搖瓶水平上表達量為30 mg/L),后續(xù)將通過菌種改良和發(fā)酵條件優(yōu)化等方法,進一步提高STI的表達量,以期實現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)從而替代現(xiàn)有的制備方法,并為其在食品和醫(yī)藥等行業(yè)的應用奠定良好的基礎(chǔ)。

生化特征的分析表明,重組STI具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性(圖2和圖3),這與黑豆[14]、野生月桂印加豆(Ingalaurina)[15]和酸豆(Tamarindusindica)[16]等來源的胰蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性相似。與許多蛋白一樣,重組STI的活性也會受到金屬離子的影響:作為常用的對酶有激活作用的K+、Mg2+對STI也有激活作用;一般重金屬會抑制酶蛋白的活性,而Cu2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+和Fe3+卻對STI有抑制作用(圖4)。Kunitz型蛋白酶抑制劑一般與酶分子可逆地進行結(jié)合,形成穩(wěn)定的復合物,以競爭性和非競爭性方式影響其活性[16]。本研究獲得的抑制劑STI與黑豆[14]以及海紅豆(Adenantherapavonina)胰蛋白酶抑制劑[17]具有相同的抑制方式,屬于非競爭性抑制劑(圖5),且對胰蛋白酶具有較強的抑制作用和較好的抑制專一性(表2),適用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[16];而即墨野生大豆[12]和酸豆[16]等來源的胰蛋白酶抑制劑則為競爭性抑制劑。

4 結(jié)論

本研究通過分子克隆與遺傳重組技術(shù)，將大豆胰蛋白抑制劑基因sti在畢赤酵母中進行了成功表達。所表達的STI在40～80 ℃或pH 2.0～11.0孵育1 h后,仍能保持85%以上的抑制活性,具有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性;而且它還是一種胰蛋白酶專一性的、非競爭性抑制劑。這為后續(xù)實現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)和挖掘其應用價值提供基礎(chǔ)材料和技術(shù)支持。