黑曲霉誘導(dǎo)子促進(jìn)青錢(qián)柳細(xì)胞合成三萜的氧化應(yīng)激機(jī)制

,,,,, ,,,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045; 2.江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045)

青錢(qián)柳(Cyclocaryapaliurus(Bata1)Iljinskaja)為我國(guó)特有的胡桃科珍稀喬木,多零星分布于我國(guó)華南地區(qū),民間常以青錢(qián)柳葉制作保健茶。青錢(qián)柳葉含有三萜、黃酮、多糖、有機(jī)酸、甾醇及生物堿等多種生物活性成分[1],因而具有降糖[2]、降脂[3]、抗癌[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等多種生物活性。2014年,青錢(qián)柳被列入新食品原料目錄,引起了科研和生產(chǎn)人員的廣泛關(guān)注。但青錢(qián)柳繁育困難,資源稀缺,嚴(yán)重制約了其開(kāi)發(fā)與利用。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),建立了穩(wěn)定的青錢(qián)柳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系,以此生產(chǎn)三萜酸等活性次級(jí)代謝產(chǎn)物,有望解決青錢(qián)柳資源匱乏的難題[7]。

誘導(dǎo)子是指能夠促進(jìn)植物產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)、促進(jìn)植物防御性次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的一類(lèi)觸發(fā)因子[8]。研究表明,萜類(lèi)可作為植物抵御病原體侵害的防御性化學(xué)物質(zhì),該物質(zhì)的積累可提高植物對(duì)病原體的抵抗作用[9]。熊瓊瓊等[10]在青錢(qián)柳細(xì)胞培養(yǎng)的第4 d加入真菌誘導(dǎo)子(Aspergillusnigerelicitor,ANE)進(jìn)行誘導(dǎo)(終濃度為200 μg/mL),3 d后總?cè)频暮繛閷?duì)照組的10.21倍,達(dá)到49.52 mg/g。由此可見(jiàn),外源添加ANE可以有效促進(jìn)青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞合成三萜類(lèi)物質(zhì)。

本文通過(guò)研究ANE作用下青錢(qián)柳細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶的表達(dá)及其活性變化情況,從氧化應(yīng)激層面探索ANE促進(jìn)細(xì)胞合成三萜的作用機(jī)制,旨在為植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)活性次級(jí)代謝物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;MS培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;甲醇(色譜純) 美國(guó)天地有限公司;其余分離用有機(jī)溶劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;CAT、SOD、POD、PAL、PLC酶活力測(cè)定ELISA試劑盒 上海逸晗生物科技有限公司;植物RNA提取試劑盒(Easy Pure? Plant RNA Kit) 北京全式金生物有限公司。

DHG-9101.2S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;SB-3200DTDN超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物技術(shù)有限公司;DEAAXO4033型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS、Hiseq4000 Truseq SBS Kit v3-HS(200 cycles) Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青錢(qián)柳細(xì)胞的懸浮培養(yǎng) 參考熊瓊瓊等[10]的方法。具體操作及條件如下:準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g濕重的青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,接種至裝有40 mL MS培養(yǎng)液(內(nèi)含1.0 mg/L激動(dòng)素(KT)+0.5 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.3 mg/Lα-萘乙酸(NAA)+30 g/L蔗糖,pH=6.0)的100 mL的錐形瓶中,并置于溫度(28±1) ℃,轉(zhuǎn)速115 r/min的搖床上進(jìn)行全暗培養(yǎng)。

1.2.2 黑曲霉誘導(dǎo)子的制備 參照熊瓊瓊等[10]的方法制備黑曲霉誘導(dǎo)子。

1.2.3 黑曲霉誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo) 參考熊瓊瓊等[10]的方法。在懸浮細(xì)胞接種后第4 d,向培養(yǎng)體系中加入ANE,使得培養(yǎng)體系中ANE的終濃度為200 μg/mL,并收獲誘導(dǎo)不同時(shí)間段(0、2、4、6、8、10、12、15、18、21、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78 h)的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,同時(shí)對(duì)照組加入與ANE等體積的蒸餾水,每組3個(gè)平行。

1.2.4 青錢(qián)柳細(xì)胞三萜類(lèi)化合物的提取與檢測(cè) 參照Ping等[7]的方法,提取和檢測(cè)青錢(qián)柳懸浮細(xì)胞三萜類(lèi)物質(zhì)。HPLC檢測(cè)條件如下:色譜柱為Waters C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.2%醋酸水(A)和甲醇(B),流速:0.85 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm,柱溫:40 ℃,洗脫條件為0～10 min,B 0%～82.5%;10～30 min,B 82.5%～90%;30～40 min,B 90%～90%。

1.2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)酶的活性測(cè)定及分析 粗酶的提取:參考Zhang等[13]的方法。將不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)收獲的青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞(0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、15、18、21、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78 h)進(jìn)行抽濾，將青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抽濾,取鮮重為1 g的青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,加4 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH=7.0),液氮研磨勻漿,混勻后4 ℃、3000 r/min離心10 min,上清液為粗酶提取液。

酶活的測(cè)定:按照試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的方法,測(cè)定氧化應(yīng)激相關(guān)酶(SOD、POD、CAT、PAL、PLC)的活力。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量 按1.2.3方法分別收獲誘導(dǎo)作用不同時(shí)間段的新鮮懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩７謩e選取對(duì)照組CK(未添加誘導(dǎo)子)、ANE誘導(dǎo)20、60 h后的三個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本試驗(yàn)中樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基于HiSeq平臺(tái),測(cè)序試驗(yàn)采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,其操作流程如下:樣品總RNA提取、總RNA質(zhì)量檢測(cè)、cDNA文庫(kù)建立、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)過(guò)濾及從頭組裝、相關(guān)基因功能注釋。完成上述工作后,利用Bowtie軟件[14]將各個(gè)樣品測(cè)序得到的Fragments與注釋的相關(guān)基因進(jìn)行分析,利用RSEM軟件[15]對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì),采用FPKM法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量。FPKM值(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads,FPKM)是衡量基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn),即每百萬(wàn)條序列中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)目,具體公式如下:

FPKM=cDNA Fragments/(Mapped Reads(Millions)×Transcript Length(kb))

公式中,cDNA Fragments表示比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的片段數(shù)目;Mapped Read(Millions)表示Mapped Read總數(shù);Transcript Length(kb)表示轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度。采用edgeR軟件對(duì)注釋的相關(guān)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析,獲得不同樣本間表達(dá)量不同的差異基因,當(dāng)相關(guān)基因滿(mǎn)足FDR<0.05且log2|FC|≥1條件時(shí),其為差異表達(dá)基因(FDR表示錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率,FC為差異倍數(shù))。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel和DPS(6.55專(zhuān)業(yè)版)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù),每個(gè)樣品進(jìn)行三次平行測(cè)定,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ANE誘導(dǎo)下青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞三萜含量的變化

ANE作用下青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞總?cè)坪康淖兓鐖D1所示。在接種后第4 d時(shí)加入ANE,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞三萜含量呈先升高后降低的趨勢(shì),而對(duì)照組的三萜含量一直處于較為恒定的水平。誘導(dǎo)后10 h三萜含量開(kāi)始升高,至60 h時(shí)達(dá)到最高值,含量由12.47 mg/g變?yōu)?6.46 mg/g,為對(duì)照組的3.36倍。根據(jù)Yin等[16]的研究,青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中三萜類(lèi)物質(zhì)主要為山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸等五種三萜酸,因此本文采用HPLC法對(duì)這五種三萜的含量進(jìn)行檢測(cè),據(jù)此計(jì)算三萜總含量。此前有文獻(xiàn)報(bào)道,植物受到病原體侵害后,會(huì)產(chǎn)生的一類(lèi)具有生物特異性的次級(jí)代謝產(chǎn)物(如三萜類(lèi)物質(zhì)),從而提高植物對(duì)病原體的防御能力[17]。因此,ANE可能是通過(guò)激活青錢(qián)柳細(xì)胞防衛(wèi)機(jī)制來(lái)促進(jìn)三萜合成的,因此，后續(xù)對(duì)ANE誘導(dǎo)作用下的抗氧化相關(guān)酶的基因表達(dá)情況和活性變化進(jìn)行了研究。

圖1 ANE誘導(dǎo)下青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞總?cè)坪康淖兓疐ig.1 Changes of total triterpenoids content of the suspended cultured C.paliurus cells under ANE elicitation

2.2 ANE誘導(dǎo)下細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性的變化

圖2 ANE誘導(dǎo)下青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞SOD酶活的變化Fig.2 SOD acitivity change of suspended culturedC.paliurus cell under ANE elicitation

2.2.2 ANE誘導(dǎo)下POD酶活性的變化 ANE對(duì)青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞POD酶活性的影響如圖3所示,加入ANE后,細(xì)胞內(nèi)POD酶活力開(kāi)始升高,在1 h時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值,該峰值與SOD的峰值幾乎同時(shí)出現(xiàn),之后迅速下降,在6 h降到最低后又開(kāi)始迅速上升,并在8 h時(shí)又達(dá)到一個(gè)峰值,之后又分別在21、66 h時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)峰值,且在66 h時(shí)達(dá)到最大峰值;而對(duì)照組POD酶的活性在整個(gè)試驗(yàn)期間內(nèi)無(wú)明顯變化,始終處于較低水平,且比較平穩(wěn)。POD與CAT是植物體內(nèi)的重要的氧化還原酶,可以催化H2O2分解,是植物體內(nèi)清除H2O2的關(guān)鍵酶[22-23],該酶的活性變化也可能是對(duì)ANE所致的氧化應(yīng)激的一種保護(hù)反應(yīng)。

圖3 ANE誘導(dǎo)下青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞POD酶活的變化Fig.3 POD acitivity change of suspended culturedC.paliurus cell under ANE elicitation

2.2.3 ANE誘導(dǎo)下CAT酶活性的變化 由圖4可知,ANE對(duì)胞內(nèi)CAT酶活力的影響非常明顯,誘導(dǎo)后的酶活明顯高于對(duì)照組,而對(duì)照組中CAT酶活力未發(fā)生明顯變化,一直處于相對(duì)較低的水平。加入ANE后,細(xì)胞CAT酶活力即開(kāi)始迅速升高,分別在誘導(dǎo)2、8、24、54及66 h時(shí)出現(xiàn)了5個(gè)峰值,其中以8 h的峰值比較大。CAT酶活力的變化可能是對(duì)添加誘導(dǎo)子所致的高濃度H2O2的保護(hù)性反應(yīng)。

圖4 ANE誘導(dǎo)下青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞CAT酶活的變化Fig.4 CAT acitivity change of suspended culturedC.paliurus cell under ANE elicitation

2.2.4 ANE誘導(dǎo)下PAL酶活性的變化 PAL是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶,其活性升高可使木質(zhì)素、木栓質(zhì)、多酚類(lèi)物質(zhì)含量的升高,進(jìn)而提高自身的抗病或抗逆能力,其中多酚類(lèi)物質(zhì)還具有很強(qiáng)的自由基清除能力,能抑制細(xì)胞膜脂過(guò)氧化,因此植物細(xì)胞的抗氧化活性與PAL的活性也有一定關(guān)聯(lián)[24-25]。ANE對(duì)青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞PAL酶活性的影響如圖5所示,ANE作用下，PAL酶的活性相對(duì)于對(duì)照組有明顯的提高,呈先升高后降低的趨勢(shì),分別在7、18及42 h時(shí)達(dá)到了峰值,其中以42 h時(shí)的峰值最大;此后,PAL酶的活性逐漸降低,60 h之后誘導(dǎo)組的活性低于對(duì)照組。這可能是因?yàn)殡S著次級(jí)代謝物的不斷積累,過(guò)多的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞本身產(chǎn)生了毒害作用,以致細(xì)胞通過(guò)關(guān)閉或降低相應(yīng)途徑中關(guān)鍵酶的合成,來(lái)限制次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累[26]。ANE誘導(dǎo)引起了PAL活力的升高,可能是細(xì)胞應(yīng)對(duì)誘導(dǎo)所致的胞內(nèi)ROS變化的一種保護(hù)性反應(yīng)。

圖5 ANE誘導(dǎo)下青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞PAL酶活的變化Fig.5 PAL acitivity change of suspended culturedC.paliurus cell under ANE elicitation

2.2.5 ANE誘導(dǎo)下PLC酶活性的變化 PLC是植物中脅迫信號(hào)傳遞的一個(gè)關(guān)鍵酶,其水溶性產(chǎn)物進(jìn)入胞內(nèi)后,激發(fā)鈣離子釋放,從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)鈣離子、鈣調(diào)素依賴(lài)性酶活性及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,有研究表明,植物中PLC還可能與ROS的形成有關(guān)[27-28]。ANE對(duì)胞內(nèi)PLC酶活性的影響如圖6所示,胞內(nèi)PLC的活性在添加ANE后的前5 h基本上與對(duì)照組相同,之后開(kāi)始升高,在6 h時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰值,在第24 h又出現(xiàn)了一個(gè)較大的峰值,之后迅速降低,但直至78 h還是明顯高于對(duì)照組。

圖6 ANE誘導(dǎo)下青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞PLC酶活的變化Fig.6 PLC acitivity change of suspended culturedC.paliurus cell under ANE elicitation

2.3 ANE誘導(dǎo)對(duì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

ANE誘導(dǎo)作用下,青錢(qián)柳細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)的5個(gè)酶的活性均出現(xiàn)了明顯升高,推測(cè)可能是相應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)所致,在轉(zhuǎn)錄層面上,植物細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)子的響應(yīng)常常發(fā)生于誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的中前期,因此,結(jié)合ANE誘導(dǎo)后細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)酶酶活力及三萜含量的變化,挑選誘導(dǎo)中前期的對(duì)照組(CK)、誘導(dǎo)后20 h及誘導(dǎo)后60 h的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析了誘導(dǎo)后5個(gè)酶基因的表達(dá)變化情況。在轉(zhuǎn)錄組注釋到的青錢(qián)柳細(xì)胞相關(guān)基因中,共注釋到了43個(gè)POD候選基因、12個(gè)SOD候選基因和2個(gè)CAT候選基因,其中有20個(gè)POD基因在誘導(dǎo)20、60 h后的表達(dá)量都發(fā)生了上調(diào),且有3個(gè)顯著上調(diào);3個(gè)SOD基因上調(diào);1個(gè)CAT基因表達(dá)量顯著上調(diào)(如表1所示)。此外,本文在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中還注釋到了6個(gè)PAL候選基因與19個(gè)PLC候選基因,其中4個(gè)PAL基因發(fā)生了上調(diào)、且有3個(gè)顯著上調(diào);7個(gè)PLC基因發(fā)生了上調(diào),但都不顯著(如表1所示)。以上結(jié)果表明,ANE誘導(dǎo)可導(dǎo)致青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,進(jìn)而引起氧化應(yīng)激相關(guān)酶的基因表達(dá)量的上調(diào),相應(yīng)的酶活力因此升高。誘導(dǎo)作用下抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活力升高,一方面保護(hù)了細(xì)胞免受氧化損傷,另一方面也通過(guò)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)了三萜化合物的合成。

表1 ANE誘導(dǎo)對(duì)青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)酶基因表達(dá)的影響Table 1 Effects of ANE elicitation on the expression of related genes to oxidative stress

2.4 ANE誘導(dǎo)對(duì)胞內(nèi)三萜合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

在植物當(dāng)中,萜類(lèi)合成主要通過(guò)兩條途徑進(jìn)行(圖7),包括甲羥戊酸(MVA)途徑與2-甲基赤蘚醇磷酸(MEP)途徑,上述兩條途徑均以異戊二烯焦磷酸(IPP)及其雙鍵異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAP)為共同中間產(chǎn)物,合成下游合成途徑中的各種萜類(lèi)物質(zhì),此過(guò)程涉及多種萜類(lèi)合成酶[29]。青錢(qián)柳細(xì)胞中三萜合成途徑的通量增加,即三萜合成相關(guān)酶基因的表達(dá)量上調(diào)是細(xì)胞中三萜含量增加的直接原因。如表2所示,在ANE誘導(dǎo)子的作用下,轉(zhuǎn)錄組注釋到的35個(gè)三萜合成相關(guān)酶基因均發(fā)生不同程度的差異表達(dá),其中MVA途徑上的相關(guān)合成酶基因普遍發(fā)生上調(diào),而MEP上游途徑中合成酶相關(guān)基因(如DXS、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH)的表達(dá)則普遍發(fā)生了略微下調(diào)變化,說(shuō)明在青錢(qián)柳細(xì)胞當(dāng)中,三萜類(lèi)物質(zhì)主要是通過(guò)MVA途徑進(jìn)行合成的。結(jié)合三萜含量以及氧化應(yīng)激相關(guān)酶活力變化可知,ANE誘導(dǎo)子可激活青錢(qián)柳細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng),繼而通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),促進(jìn)細(xì)胞當(dāng)中三萜合成酶相關(guān)基因的表達(dá),最終促進(jìn)青錢(qián)柳細(xì)胞中三萜類(lèi)物質(zhì)的積累。

圖7 萜類(lèi)化合物生物合成途徑Fig.7 Biosynthetic pathway for terpenoids

表2 三萜代謝途徑中的差異表達(dá)基因Table 2 The differentlly expressed genes of terpenoids biosynthetic pathway

3 討論與結(jié)論

植物在遭受逆境脅迫時(shí)(如病原體侵染時(shí)),細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除之間的平衡會(huì)受到破壞,從而出現(xiàn)ROS的積累。一方面,ROS可直接殺滅侵染植物的病原體,另一方面,ROS又可作為信號(hào)分子直接或間接激活某些防衛(wèi)基因的表達(dá),從而促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)防御性次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。但過(guò)多的ROS會(huì)對(duì)植物自身造成傷害,因此植物體內(nèi)有一套完整的氧化與抗氧化的平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng),即ROS大量積累時(shí),各種抗氧化酶活性也隨之上升[30]。

SOD、POD及CAT是細(xì)胞內(nèi)清除ROS的三種重要的抗氧化酶。張長(zhǎng)平等[31]使用真菌誘導(dǎo)子提高了南方紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中萜類(lèi)物質(zhì)(紫杉醇)的含量,其結(jié)果表明,PAL、POD、CAT和SOD酶的活力也發(fā)生了時(shí)序性變化。侯丕勇等[32]發(fā)現(xiàn),真菌誘導(dǎo)子能誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖中LOX、PAL和POD活性的升高,從而提高了總生物堿的含量。翟俏麗等[33]在白樺懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中添加真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)1 d后,三萜含量比對(duì)照組增長(zhǎng)了78%,且在誘導(dǎo)6～10 h內(nèi),POD和PAL酶的活性分別是對(duì)照組的5.74、5.70倍。

PAL是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶,其活性升高可促進(jìn)植物黃酮、茶醌類(lèi)色素及木質(zhì)素類(lèi)物等物質(zhì)的積累,繼而增強(qiáng)植物本身的抗氧化、抗病或抗逆能力。本文研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)ANE處理后青錢(qián)柳細(xì)胞PAL酶的活性顯著提高,在18 h時(shí)達(dá)到最大,其后又在42 h時(shí),再次上升達(dá)到最大峰值,這與劉長(zhǎng)軍等[34]報(bào)道的ANE作用新疆紫草細(xì)胞后PAL酶活性明顯增加的結(jié)果相似。

PLC是植物中脅迫信號(hào)傳遞的一個(gè)關(guān)鍵酶,其水溶性產(chǎn)物進(jìn)入胞內(nèi)后,激發(fā)鈣離子釋放,從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)鈣離子、鈣調(diào)素依賴(lài)性酶活性及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[27]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),添加ANE后,青錢(qián)柳細(xì)胞PLC的活性明顯提高,這可能是PLC介入了ANE對(duì)細(xì)胞三萜類(lèi)物質(zhì)合成的誘導(dǎo)作用過(guò)程,但具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

此外,在轉(zhuǎn)錄水平上,本實(shí)驗(yàn)表明,在ANE的誘導(dǎo)下,細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的5個(gè)酶的基因表達(dá)量明顯上調(diào),三萜合成途徑中合成酶相關(guān)基因表達(dá)亦發(fā)生上調(diào)。由此可見(jiàn),真菌誘導(dǎo)子是一種能促進(jìn)青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中三萜類(lèi)物質(zhì)積累的誘導(dǎo)因子,在其誘導(dǎo)作用下,青錢(qián)柳細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激,隨后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)被激活,繼而促進(jìn)三萜合成酶相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生上調(diào),并最終促進(jìn)青錢(qián)柳細(xì)胞當(dāng)中三萜類(lèi)物質(zhì)的積累。