用于評價大小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的迷宮實驗方法比較

楊玉潔，李玉姣，李杉杉, 劉新民，王 瓊 *

(1.西南醫(yī)科大學(xué) 附屬中醫(yī)醫(yī)院 中葡中醫(yī)藥國際合作中心，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥理教研室，四川 瀘州 646000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

評價大小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力時，迷宮類實驗是最經(jīng)典、最常用的檢測手段，根據(jù)實驗原理一般可分為水迷宮、電迷宮、食物迷宮等。迷宮最早出現(xiàn)于19世紀(jì)末，美國心理學(xué)家桑代克的小貓迷籠實驗，是研究動物心理學(xué)的開端，也是迷宮實驗的最早應(yīng)用。后來逐漸發(fā)展，出現(xiàn)了其他各式各樣的迷宮。本篇綜述通過搜集Morris水迷宮、Y迷宮、八臂迷宮、T迷宮、Barnes迷宮實驗的實驗方法、實驗原理、注意事項、評價指標(biāo)、應(yīng)用特點，分析各自優(yōu)缺點，為更好利用迷宮實驗評價大小鼠學(xué)習(xí)記憶能力提供參考。

1 五種迷宮簡介

1.1 Morris水迷宮

Morris水迷宮是利用大小鼠會游泳又怕水的天性，強迫其在水中游泳，依靠空間參考標(biāo)志判定平臺的位置擺脫水環(huán)境。實驗?zāi)Ｊ接腥N：定位航行模式、空間探索模式、工作記憶模式。定位航行實驗時，動物從不同象限的中點放入迷宮，記錄其登上平臺的時長(潛伏期)?？臻g探索實驗考察其對平臺位置的記憶，記錄動物的穿臺次數(shù)。工作記憶模式是定位航行實驗后，每天改變平臺位置，給予動物5～10 s的觀察時間，檢測動物在短時間內(nèi)對平臺新位置的記憶(即工作記憶)。

注意事項：(1)實驗人員勿隨意走動，室內(nèi)物品位置勿變動。(2)小鼠實驗時水溫維持在20℃～23℃，水溫過高，則小鼠不愛游動。大鼠因體積大，耗能多，水溫在24℃～26℃之間。(3)實驗前水中加入墨汁或牛奶、無毒的涂料，更好地隱匿平臺。(4)實驗前后，將動物置于平臺上休息一段時間，使動物觀察迷宮四周環(huán)境，幫助記憶。(5)防止動物因視覺問題影響尋臺，可在水迷宮實驗前或后進行可視平臺實驗。(6)平臺應(yīng)放置在象限的中間，不要放置在水池邊緣，避免動物按邊緣式搜索策略無意找到平臺。

1.2 Y迷宮

Y迷宮可進行兩種實驗：電Y迷宮實驗，Y迷宮自主交替實驗。

電Y迷宮實驗是利用鼠類避明趨暗的習(xí)性設(shè)計的一種條件反射實驗裝置，其三條臂內(nèi)均裝有燈泡和電網(wǎng)，燈亮的臂無電，而暗臂有電，隨機更換安全臂訓(xùn)練動物的空間辨別學(xué)習(xí)能力。實驗分為三個階段，先是訓(xùn)練期，當(dāng)動物主動逃避次數(shù)達(dá)到80%以上，則可進入測試階段，最后還可進行記憶再現(xiàn)階段。訓(xùn)練期記錄動物達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)進行的電擊總數(shù)和動物出錯總數(shù)，作為學(xué)習(xí)的評定指標(biāo)。測試期統(tǒng)計動物足底電擊中的出錯總數(shù)，作為記憶的評定指標(biāo)[1-3]。記憶保持是考察動物經(jīng)過一段時間后再放入迷宮，以評價動物記憶力的高低。

Y迷宮自主交替實驗，完全利用嚙齒類動物對新奇環(huán)境探索的天性，動物必須依靠前一次的記憶做出正確的進臂選擇，可有效地評價動物的空間工作記憶能力。實驗時將動物放入一條臂的末端，讓其自由探索幾分鐘，一段時間后將動物再次放入迷宮進行正式檢測。記錄動物進入各臂的順序和總次數(shù)，當(dāng)連續(xù)三次進入不同的臂時，記為一次正確交替反應(yīng)，統(tǒng)計正確交替反應(yīng)次數(shù)[4]，計算自主交替率。注意事項：對于電Y迷宮，應(yīng)選擇合適的電壓。

1.3 T迷宮

T迷宮是依靠覓食動機誘導(dǎo)動物完成任務(wù)的一種迷宮，檢測前需對動物進行禁食。實驗中，動物對目標(biāo)臂的選擇基于記住上次探索過的目標(biāo)臂，即空間工作記憶，動物對目標(biāo)臂的正確交替選擇是完整工作記憶能力的體現(xiàn)[5]。T迷宮包括自發(fā)連續(xù)交替實驗和交替選擇實驗兩種模式[6]，自發(fā)連續(xù)交替實驗?zāi)Ｊ綍r，動物不用禁食，完全借助其愛探索的天性。先讓動物完全適應(yīng)迷宮后，進行一次初始強制實驗和六次選擇實驗，即關(guān)閉其中一條目標(biāo)臂，動物從起始箱放入，使其探索另一條開放的目標(biāo)臂，待進入目標(biāo)臂后，又重新放回起始箱。10 s后開放閘門，讓其自由探索兩條目標(biāo)臂，待其進入其中一條臂后，關(guān)閉另一條臂，再次放回起始箱，10 s后進入下一次選擇實驗，循環(huán)進行六次。而交替選擇實驗?zāi)Ｊ绞莿游锝澈?，進行7～8 d的適應(yīng)性訓(xùn)練和1 d的正式訓(xùn)練，即適應(yīng)迷宮后，在兩條目標(biāo)臂中隨機選擇一條臂末端放入食餌，關(guān)閉另一條臂。將動物放入起始箱，使其進入目標(biāo)臂獲取食餌，連續(xù)訓(xùn)練一段時間后(保證左右兩臂放食餌的次數(shù)相等)進入正式實驗階段[7]。先是強迫訓(xùn)練，選擇一條臂開放并放入食餌，另一條臂關(guān)閉，當(dāng)動物進入有食餌的臂獲得獎勵后，將其馬上放回主干臂，而后讓其自由探索左右兩臂，此前強迫訓(xùn)練時放食餌的臂中無食餌，其對側(cè)臂有食餌。動物若進入無食餌的臂，記為一次“錯誤次數(shù)”，反之為“正確次數(shù)”，重復(fù)測試多次。統(tǒng)計總的正確率，正確率越高，潛伏期越短，表明動物工作記憶越好[8]。注意事項：當(dāng)為交替選擇模式時，動物須禁食，至體重減輕為原來的85%～90%，促使動物覓食。

1.4 八臂迷宮

八臂迷宮以動物尋覓不同臂中的食餌來評價其空間學(xué)習(xí)記憶能力，實驗分為訓(xùn)練期和檢測期。訓(xùn)練期：將食餌放入八條臂末端食盒內(nèi)，動物從中央?yún)^(qū)放入，讓其自由尋覓食餌。重復(fù)訓(xùn)練多天，記錄動物進臂次數(shù)，訓(xùn)練期反映的是依賴海馬有關(guān)的陳述性記憶[9]。檢測期：隨機在4條臂中放入食餌，另外4條臂關(guān)閉，動物限定時間內(nèi)探索4條開放臂，待動物獲得全部食餌后將其放回中央?yún)^(qū)等待一段時間后，開放迷宮八條臂進行測試(之前沒放食餌的臂放入食餌)。檢測期主要反映了依賴紋狀體的習(xí)慣性記憶[10]。注意事項：(1)每天訓(xùn)練完后，將整個迷宮旋轉(zhuǎn)180°，防止動物依靠反向記憶記住空間位置。(2)迷宮周圍的所有物品位置需保持不變，防止動物定位不準(zhǔn)確。

1.5 Barnes迷宮

Barnes 迷宮是利用嚙齒動物喜暗避明的習(xí)性設(shè)計，通過強光照射與噪聲刺激迫使動物在規(guī)定時間內(nèi)尋找指定位置孔洞下的暗箱。實驗分為訓(xùn)練期和測試期，連續(xù)訓(xùn)練幾天后測試，記錄動物進入暗箱的時間、總路程、速度等[11]，以及進入錯誤洞口的次數(shù)以反映動物空間參考記憶能力，也可以通過記錄動物重復(fù)進入錯誤洞口次數(shù)來測量動物的工作記憶。注意事項：每次訓(xùn)練后要隨機轉(zhuǎn)動迷宮，保證連續(xù)兩天迷宮位置不同，但目標(biāo)箱位置不改變。當(dāng)動物在其他洞旁徘徊時，其頭部伸入洞內(nèi)，眼睛低于平臺邊緣時，判斷為逃生錯誤[12]。

2 五種迷宮實驗方法比較

表1 五種迷宮實驗方法及應(yīng)用列表Table 1 Five maze tests and their applications

表2 五種迷宮的優(yōu)缺點比較Table 2 Comparison of the advantages and disadvantages of the five mazes

3 迷宮實驗評價動物學(xué)習(xí)記憶能力的研究

鄭紅[19]等人發(fā)現(xiàn)重復(fù)Morris水迷宮訓(xùn)練能提高動物空間學(xué)習(xí)能力，但不提高動物空間記憶能力，這說明空間學(xué)習(xí)和空間記憶能力有不同的機制，兩者之間無必然聯(lián)系。此外，動物的品系、年齡、性別都會影響動物在水迷宮實驗中的表現(xiàn)，C57BL/6小鼠的參考記憶能力和工作記憶能力均比昆明種小鼠和ICR小鼠表現(xiàn)稍好[20]。雌性C57BL/6小鼠和昆明小鼠在參考記憶中的表現(xiàn)明顯優(yōu)于同品系雄性小鼠。而BALB/c小鼠不適合進行Morris水迷宮實驗[21]。此外，6月齡SD雌性大鼠比2月齡的尋臺潛伏期短，而SD雄性大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力也在6月齡時最好，6月齡之前呈現(xiàn)逐漸增強趨勢，以后緩慢下降，至24月齡時降至1月齡水平，說明SD大鼠，不管雄性還是雌性，其學(xué)習(xí)記憶能力在 6月齡時最強[22]。

Y迷宮除了檢測空間學(xué)習(xí)記憶外，還可檢測動物對空間位置覺和方向覺的辨別能力、逃避條件反射能力、空間工作記憶(一種短期記憶)和片段式記憶[23]。

八臂迷宮用于評價實驗動物的空間記憶和非空間記憶，能很好的區(qū)分參考記憶和工作記憶。在大量疾病動物模型研究中均有應(yīng)用，包括長期高脂飲食模型、睡眠剝奪模型[24]、腦創(chuàng)傷模型，尤其對多種發(fā)育毒性物質(zhì)敏感，也有在猴子和人的研究中應(yīng)用[25]。

T迷宮既可以檢測實驗動物空間學(xué)習(xí)和記憶能力，也可利用自發(fā)交替實驗檢測動物空間工作記憶能力，自發(fā)交替是一個短期的記憶任務(wù)，評估動物對之前進入過迷宮臂的記憶能力，并在重新進入迷宮臂時選擇另一條臂。在應(yīng)用T迷宮和Barnes迷宮對腦缺血模型進行研究時，發(fā)現(xiàn)腦缺血引起的神經(jīng)認(rèn)知缺陷與工作(短期)記憶密切相關(guān)，而對長期參考記憶影響較小。Barnes迷宮是用于檢測動物的視覺空間學(xué)習(xí)和記憶能力[26]。

4 迷宮實驗評價學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)機制研究

大量研究已證實學(xué)習(xí)記憶和海馬關(guān)系密切，紋狀體邊緣區(qū)與前額葉皮質(zhì)也參與學(xué)習(xí)記憶過程。當(dāng)海馬或海馬周圍區(qū)域損傷時，會出現(xiàn)空間定位記憶障礙。動物海馬體中含有細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理過程中起重要作用，主要的MMP3與MMP9參與空間學(xué)習(xí)記憶過程，研究表明抑制海馬體中MMP3和9活性會顯著降低獲取空間記憶任務(wù)的能力[27]。另外，海馬中BDNF mRNA表達(dá)水平也與海馬依賴性空間記憶有關(guān)[28]。海馬內(nèi)神經(jīng)元的凋亡對空間學(xué)習(xí)記憶也有顯著損傷[29]，通過抑制caspase-3和促進海馬體CA1區(qū)域神經(jīng)元bcl-2的表達(dá)，是一種很好的改善認(rèn)知的方法。在糖尿病伴發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙的研究中，模型動物在早期會出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶能力減退，工作記憶和參考記憶處理速度減緩，這與腦內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸受體 (NMDARs) 表達(dá)的激活有關(guān)，高血糖會引起腦組織缺血缺氧，谷氨酸大量釋放并過度刺激NMDARs受體，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的減少[30]。此外，海馬僅參與電Y迷宮逃避性學(xué)習(xí)記憶任務(wù)鞏固的早期階段，而紋狀體邊緣區(qū)參與學(xué)習(xí)記憶任務(wù)鞏固的早期和晚期階段[31]。研究表明背側(cè)海馬區(qū)受損對T迷宮中視覺操作辨別任務(wù)影響不大，但會嚴(yán)重影響延遲交替任務(wù)；而背側(cè)紋狀體區(qū)受損會嚴(yán)重?fù)p害視覺操作辨別任務(wù)，但對延遲交替任務(wù)的完成無影響。除海馬體和紋狀體外，前額葉皮質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，尤其在工作記憶上[32]。內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)與空間工作記憶相關(guān)的神經(jīng)元編碼會介導(dǎo)大鼠在T迷宮中延遲交替響應(yīng)任務(wù)的選擇行為[33]。

5 討論

除了文中的五種迷宮外，近年也出現(xiàn)幾種新型迷宮，如八臂水迷宮、Y型水迷宮等，這種多臂型水迷宮對檢測輕度學(xué)習(xí)記憶能力下降的敏感性比Morris迷宮強，也避免了在Morris水迷宮中的趨觸性行為(即靠池邊游泳的傾向)。

為了更好的研究與神經(jīng)科學(xué)相關(guān)的疾病，選擇合適的認(rèn)知行為學(xué)實驗進行研究十分重要。在評價海馬依賴性的空間學(xué)習(xí)和記憶功能時，Morris 水迷宮、Barnes迷宮均適合，它們具有一個共同的特點：在一個大的開放性的圓形空間內(nèi)找到一個離散的目標(biāo)。Morris迷宮是讓動物在一個安靜的環(huán)境中進行空間巡航任務(wù)，而Barnes迷宮使動物處于強光或噪音下去完成任務(wù)，這可能會分散動物尋找空間線索的注意力，影響實驗的準(zhǔn)確性[34]，所以Morris水迷宮的實驗結(jié)果更可靠。同時，有大量研究采用Morris水迷宮來評價動物的工作記憶，但有研究者指出Morris水迷宮在工作記憶能力檢測上的不敏感性，考慮到Y(jié)迷宮(自發(fā)交替實驗)和T迷宮操作簡便，用時少，更適合用于檢測大小鼠的工作記憶。Y迷宮有多種實驗?zāi)Ｊ?，研究者們開始減少使用電刺激和飲食限制的實驗方法，而采取利用嚙齒類動物天生的探索心理去完成迷宮任務(wù)，可用于評價動物空間識別記憶能力[35]。放射迷宮既可用于檢測空間記憶能力，也可檢測動物的工作記憶能力，其以動物覓食天性為原理，雖避免了厭惡刺激，但這種食物誘導(dǎo)動機可能導(dǎo)致結(jié)果的不可信，同樣的其他食物迷宮也有相同的問題[36]。目前，迷宮實驗主要應(yīng)用于大小鼠上，而對其他哺乳動物的研究和應(yīng)用上較少，所以應(yīng)加大對非人靈長類動物迷宮類實驗的研發(fā)與應(yīng)用。