Tlr4基因敲除小鼠生長和繁殖的實驗研究

鄭 洋，王佳慧，劉露露，黎桂玉，彭 岳，趙鐵建*

(1.研究生學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；廣西中醫(yī)藥大學(xué), 南寧 530001)

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類天然免疫受體，能引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用[1]。其中TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLRs相關(guān)蛋白，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是其主要配體[2-3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，TLR4表達(dá)于各類肝臟細(xì)胞中，可以調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)，參與肝臟的病理生理過程，在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。為了深入研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，本課題組購買了Tlr4基因敲除的小鼠，在造肝纖維化模型前的飼養(yǎng)階段，研究人員發(fā)現(xiàn)Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠在生長和繁殖方面具有一些差異，所以本文將兩種小鼠進(jìn)行比較，為研究Tlr4基因在肝纖維化形成過程中的作用，提供更加完整詳細(xì)的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級Tlr4基因敲除小鼠20只，雌雄各半，2周齡，體重4～10 g，購買于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，種系為C57BL/10ScNJNj，合格證號[SCXK(蘇)2015-0001]，清潔級KM小鼠20只，雌雄各半，2周齡，體重10～15 g，購買于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，合格證號[SCXK(湘)2016-0002]。使用許可證號[SYXK(桂)2015-0001]。按照實驗動物使用的3R原則予以人道關(guān)懷。

按照清潔級動物的環(huán)境要求飼養(yǎng)兩個小鼠品系，環(huán)境中溫度25℃左右，相對濕度控制在30%～60%，小鼠籠和飲水瓶每3 d用84消毒液和75%酒精消毒一次，鼠籠的墊料、飼料、水均經(jīng)滅菌處理，墊料3 d更換一次。兩個小鼠品系均采用一雌一雄同籠進(jìn)行繁殖。

1.2 主要儀器

電子天平HLD-10001(四川中浪科技有限公司)，最大稱重重量為1000 g，精度為0.1 g?？ǔ逜635051(上海艾測電子科技有限公司)，范圍為0～150 mm，分辨率為0.05 mm。

1.3 實驗方法

在周齡剛好達(dá)到時測量體重和體長。體長指雙耳連線的中點到尾體交接處，體長測量需借助于不銹鋼網(wǎng)，當(dāng)小鼠在網(wǎng)上抓緊時，拉住它的尾巴使其自然伸直，然后進(jìn)行測量。增長率=(體重或體長-第2周的體重或體長)/第2周的體重或體長。從第4周開始一直測量到12周結(jié)束，因為小鼠的哺乳期約為3周，在6周齡的時候是性成熟的時間段，所以選擇快速進(jìn)展期的小鼠進(jìn)行測量。繁殖能力的測量對象是一雄一雌所產(chǎn)的第2胎的幼仔數(shù)量，可代表繁殖能力[5-6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠生長的比較

2.1.1 小鼠體重及其增長率的比較

Tlr4基因敲除小鼠體重及其增長率明顯小于KM小鼠，從第4周到第12周差異顯著(P< 0.05)，詳細(xì)見表1～2。

2.1.2 小鼠體長及其增長率的比較

在第4周和第5周兩者相比差異不明顯，P> 0.05；在其它的時間段，Tlr4基因敲除小鼠體長及其增長率明顯小于KM小鼠，P< 0.05。具體見表3～4。

表1 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠體重比較(g, n=20)Table 1 Comparison of the body weight of Tlr4 knockout mice and KM mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表2 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠體重增長率比較(%，n=20)Table 2 Comparison of the body weight growth rates between Tlr4 knockout mice and KM mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

2.2 小鼠繁殖能力的比較

在Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠的群體中，隨機(jī)選取20籠一雄一雌合籠的小鼠為研究對象，統(tǒng)計其第2胎所產(chǎn)的幼仔個數(shù)，具體見表5，Tlr4基因敲除小鼠繁殖能力明顯小于KM小鼠，P< 0.05。

3 討論

本課題組用Tlr4基因敲除小鼠制備肝纖維化模型，研究Tlr4如何通過NF-KB、MARKs兩條信號通路在肝臟炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，Tlr4基因敲除小鼠成本高昂，而在制備肝纖維化模型過程造中，小鼠死亡率較高，因此如何更好的飼養(yǎng)以及將基因敲除小鼠品系保存下去，具有十分重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)Tlr4基因敲除小鼠在生長和繁殖均弱于正常KM小鼠,而Tlr4已經(jīng)證實和多種疾病的發(fā)生相關(guān)，例如肝纖維化，如果研究Tlr4和肝纖維化之間的關(guān)系，Tlr4基因敲除小鼠則是理想的動物模型，因為Tlr4通過MyD88調(diào)控NF-κB、MAPKs兩條信號通路[7]，當(dāng)Tlr4基因被敲除后，這兩條通路的信號傳導(dǎo)被阻斷，通過對信號通路中的關(guān)鍵分子檢測，可以得到疾病相關(guān)的分子機(jī)制，以及Tlr4和肝纖維化之間的關(guān)系。所以正確的飼養(yǎng)，對于Tlr4基因敲除小鼠的獲得和保種十分重要。在飼養(yǎng)Tlr4基因敲除小鼠的過程中，報告發(fā)現(xiàn)有食子的現(xiàn)象，有研究表明很多基因敲除小鼠都有食子現(xiàn)象[8]，根據(jù)李巍[9]的飼養(yǎng)方法進(jìn)行改良，減少每天觀察小鼠的次數(shù)，這樣可以減少對小鼠的驚嚇，給予花生米、葵花籽以及熟雞蛋黃發(fā)現(xiàn)食子現(xiàn)象得到很好的緩解，另Tlr4基因敲除的小鼠比KM小鼠對環(huán)境的要求更高，在飼養(yǎng)過程中，如果消毒不及時或者對飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生處理不得當(dāng)，基因敲除小鼠會出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，筆者認(rèn)為這可能和其Tlr4基因敲除，使其免疫力下降有關(guān)，有研究表明TLR4與免疫力的關(guān)系密切[10]。TLR4是TLR4信號通路中的關(guān)鍵分子也可以調(diào)控NF-κB、MAPKs信號通路，這些信號通路都是炎性通路。有研究表明[11]，發(fā)生炎性疾病時，使用藥物抑制TLR4表達(dá)后疾病的嚴(yán)重程度下降。但當(dāng)敲除Tlr4基因后，免疫細(xì)胞表面沒有TLR4的表達(dá)，TLR4與病原體的結(jié)合受到阻礙，將影響機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[12]。所以Tlr4基因敲除后會對小鼠的生長產(chǎn)生很大的影響。

表3 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠體長比較(cm, n=20)Table 3 Comparison of the body length of Tlr4 knockout mice and KM mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note.There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表4 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠體長增長率比較(%，n=20)Table 4 Comparison of body length growth rates between the Tlr4 knockout mice and km mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表5 Tlr4基因敲除小鼠與KM小鼠繁殖能力(幼仔個數(shù))比較Table 5 Reproductive performance(number of cubs)of the Tlr4 knockout mice and KM mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

本研究發(fā)現(xiàn)Tlr4基因敲除對小鼠生長和繁殖的影響，在體重和其增長率上Tlr4基因敲除小鼠明顯小于KM小鼠，在體長和其增長率上在第4周和第5周時，兩個小鼠品系差異不明顯，在其它的時間段Tlr4基因敲除小鼠明顯小于KM小鼠，在繁殖上Tlr4基因敲除小鼠明顯弱于KM小鼠。