超聲輔助酶法提取石莼功能性寡糖關(guān)鍵工藝優(yōu)化

李燕妹，呂 峰，許雅楠，鄭敦信

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

石莼資源豐富，味道鮮美，富含許多營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的食用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究表明，石莼中的碳水化合物豐富，其所含的活性成分多糖、膳食纖維、功能性低聚糖對(duì)于提高機(jī)體免疫力、降血糖、抗氧化等功能起著重要作用[1-2]。提取石莼中的活性成分，并開發(fā)為食品、保健食品、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品的添加劑，不但可以實(shí)現(xiàn)石莼資源的高值化利用，增加其經(jīng)濟(jì)附加價(jià)值，而且減少環(huán)境污染。

寡糖是生命活動(dòng)中重要的生物活性物質(zhì)，其功能的獨(dú)特性和多樣性日益受到消費(fèi)者的青睞，因而開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。然而天然原料中的寡糖含量有限，利用有機(jī)溶劑直接浸提存在溶劑消耗量大、成本高的缺點(diǎn)。

本研究以石莼為原料，基于超聲波輔助纖維素酶提取石莼可溶性糖，通過醇沉除多糖后獲得功能性寡糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)方案優(yōu)化超聲輔助酶法提取石莼功能性寡糖關(guān)鍵工藝參數(shù)，為進(jìn)一步研究石莼功能性寡糖結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與生理活性等工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

孔石莼粉：80目，購于福清海興保健食品有限公司；

纖維素酶(比活力：20×104U/g)：購于寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；

苯酚、濃硫酸、葡萄糖、檸檬酸等試劑：均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

PL202-S100型精密分析天平：丹麥儀器(北京)有限公司；

STARTER3C pH計(jì)：奧豪斯儀器(上海)有限公司；

SK8210 LHC超聲波清洗器：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；

UV-1800 PC型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；

HWS 26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

2-16 k臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma 公司；

79-1型磁力攪拌器：上海怡臨儀器科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 石莼功能性寡糖提取工藝要點(diǎn)

1) 石莼粉懸浮液配制：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的石莼粉，并按一定比例加入蒸餾水，制成石莼粉懸浮液。

2)調(diào)節(jié)pH：由于酶對(duì)介質(zhì)的pH很敏感，只有在理想的pH范圍才能達(dá)到最大活性。用檸檬酸調(diào)節(jié)石莼粉懸浮液至纖維素酶的適宜pH。

3)超聲波輔助酶法提取石莼可溶性糖類：海藻類含有較多的纖維素，而纖維素酶具有較強(qiáng)的細(xì)胞壁破壞能力，可以使植物細(xì)胞壁疏松、破裂，充分釋放細(xì)胞內(nèi)的活性成分，提高工作效率[3-5]；超聲波操作參數(shù)范圍：溫度40～60℃，時(shí)間0.5～2.5 h，功率300～500 W。

4)滅酶：石莼可溶性糖類提取結(jié)束后，提取液立即沸水浴10 min，以此鈍化酶活。

5)過濾、離心：酶解液用200目篩娟布過濾，濾液在4 000×g離心力下離心10 min，收集上清液即為石莼可溶性糖類粗提液。

6)真空濃縮：石莼可溶性糖類粗提液真空濃縮(真空度0.095 Mpa、溫度55℃)至原體積的10%～15%。

7)醇沉除多糖、蛋白質(zhì)：加入石莼可溶性糖濃縮液4倍體積的無水乙醇，于冰箱靜置24 h沉淀去除多糖、蛋白質(zhì)，收集上清液，真空濃縮并去除乙醇，冷凍干燥制得石莼功能性寡糖。

1.2.2 石莼可溶性糖含量測(cè)定方法

采用苯酚硫酸法測(cè)定[6-7]。

1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作——分別吸取100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，各補(bǔ)水至2.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL，混勻，再加入濃硫酸5 mL，振蕩搖勻。吸取2 mL蒸餾水作空白，如上操作。在室溫下冷卻靜置20 min后于490 nm處測(cè)定吸光度。以糖含量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：

y=0.007 5x+0.000 6(R2=0.999 5)

(1)

2)石莼可溶性糖提取率計(jì)算：吸取1 mL石莼可溶性糖提取液于250 mL容量瓶，稀釋、定容后，取2 mL稀釋液于試管，按1.2.2中1)的方法測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到樣液中可溶性糖含量?？扇苄蕴菢悠诽崛÷视?jì)算公式如下：

(2)

式中，m：可溶性糖含量(μg)；

V1：提取液體積(mL)；

V2：吸取樣品液體積(mL)；

M：樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 超聲波輔助酶法提取石莼功能性寡糖關(guān)鍵工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以纖維素酶使用量(X1)、提取料液比(X2)、超聲提取溫度(X3)、超聲提取時(shí)間(X4) 4個(gè)因素為自變量，以石莼可溶性糖的提取率(Y)為目標(biāo)函數(shù)。采用4因素5水平的二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲波輔助酶提取石莼功能性寡糖關(guān)鍵工藝參數(shù)，其因素水平編碼見表1。

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素水平表

續(xù)表1

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)主要采用Microsoft Excel 2003、DPS v7.05和Design expert 8.06軟件進(jìn)行分析。以鄧肯新復(fù)極差法對(duì)各單因素的均值進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，顯著性界值以P<0.01為極顯著，0.010.05為不顯著；采用Design expert軟件對(duì)工藝優(yōu)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型回歸與方差分析

表2為超聲波輔助酶法提取石莼功能性寡糖關(guān)鍵工藝的二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果。運(yùn)用Design expert 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸模擬，建立石莼可溶性糖提取率(Y)與纖維素酶使用量(X1)、提取料液比(X2)、超聲提取溫度(X3)與超聲提取時(shí)間(X4)的四元二次回歸方程，對(duì)方程中各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，刪除在α=0.05顯著水平的不顯著系數(shù)相后，得到簡(jiǎn)化的數(shù)學(xué)回歸方程式：

(3)

式中自變量取各自代碼值，因變量取計(jì)算值，由回歸方程可計(jì)算出石莼可溶性糖類提取率Y值。

為進(jìn)一步確定各因素對(duì)石莼可溶性糖提取率Y的影響程度，用方差分析對(duì)所得數(shù)學(xué)回歸方程的顯著性和回歸擬合性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。表3顯示，失擬項(xiàng)F=1.60，P=0.226 5>P=0.05，失擬不顯著；方程回歸F=691.35，P=0.000 1，極顯著；模型的R2=0.997 8，自變量和響應(yīng)值之間的關(guān)系顯著，表明本試驗(yàn)得到的回歸方程擬合性好、誤差小，能夠與實(shí)際情況擬合，因此可以用來反映實(shí)際生產(chǎn)工程中纖維素酶使用量X1、提取料液比X2、超聲提取溫度X3、超聲提取時(shí)間X4與石莼可溶性糖提取率Y的相互影響關(guān)系。從表3還可以看出，模型中一次項(xiàng)、二次項(xiàng)均為差異極顯著影響因素。該模型的純誤差的均方值較小，說明此模型有效，應(yīng)用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化石莼可溶性糖的提取工藝可行。

表2 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

續(xù)表2

表3 石莼可溶性糖提取率結(jié)果方差分析表

注：**表示差異極顯著，P<0.01，*表示差異顯著，P<0.05。

Notes：**indicated that the difference was very significant，P<0.01.*indicated that the difference was significant，P<0.05.

2.2 試驗(yàn)因子對(duì)石莼可溶性糖提取率的影響趨勢(shì)

2.2.1 單因子效應(yīng)分析

對(duì)回歸方程(3)進(jìn)行降維分析，將四因子中的三個(gè)因子分別固定在0水平，分別考察各單因子在不同水平上對(duì)石莼可溶性糖提取率的影響效應(yīng)，得到以其中一個(gè)因子為決策變量的偏子回歸方程，經(jīng)Excle繪圖可得到各因子影響石莼可溶性糖提取率的曲線，如圖1所示。

由圖1和表3可知，各因子對(duì)石莼可溶性糖提取率的影響顯著性順序依次為X2(提取料液比)>X1(纖維素酶使用量)>X3(超聲提取溫度)>X4(超聲提取時(shí)間)。分別固定其他三個(gè)因素為0水平，提取料液比X2在-2(1∶ 20)至0.5(1∶ 32.5)水平范圍內(nèi)時(shí)，隨著料液比X2的增大，石莼可溶性糖的提取率Y從(9.54±0.05)%極顯著(P<0.01)上升到最大值(11.96±0.02)%，超過0.5(1∶ 32.5)水平后呈下降趨勢(shì)；超聲提取溫度、纖維素酶使用量和料液比對(duì)石莼可溶性糖提取率的影響趨勢(shì)相似，當(dāng)前二者均在0.5水平(47.5℃、425 U/g)范圍內(nèi)，石莼可溶性糖的提取率Y隨其水平的提高極顯著(P<0.01)上升到最大值(11.97±0.03)%；超過0.5水平后，石莼可溶性糖提取率Y隨超聲提取溫度的上升逐漸下降，而隨纖維素酶使用量的增加趨于平穩(wěn)(P>0.05)；在-2(0.5 h)至1(2 h)水平范圍內(nèi)，石莼可溶性糖提取率Y隨著超聲提取時(shí)間X4的延長極顯著(P<0.01)上升到最大值(11.98±0.01)%，當(dāng)超聲時(shí)間X4超過1水平(2 h)后，石莼可溶性類糖的提取率Y基本保持不變(P>0.05)。

2.2.2 因素間互作效應(yīng)分析

根據(jù)回歸方程(3)與表3的結(jié)果，采用Design expert 8.06軟件對(duì)石莼可溶性糖提取率Y的影響在α=0.05水平上有顯著性的X1X3，即(纖維素酶使用量與超聲提取溫度的交互作用)；X2X3，即(提取料液比與超聲提取溫度的交互作用)；X3X4，即(超聲提取溫度與超聲提取時(shí)間的交互作用)進(jìn)行分析。圖2至圖4分別為兩兩因素交互效應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，可直觀地反映出因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值Y的影響效應(yīng)。

圖2顯示，當(dāng)提取料液比X2和超聲提取時(shí)間X4固定在0水平時(shí)，纖維素酶使用量X1與超聲提取溫度X3的交互作用對(duì)石莼可溶性糖提取率Y有極顯著影響(P<0.01)。在-2(300 U/g、35℃)至0.5(425 U/g、47.5℃)水平范圍內(nèi)，纖維素酶使用量X1與超聲提取溫度X3的交互作用對(duì)石莼可溶性糖提取率Y的影響具有極顯著的正相關(guān)交互關(guān)系(P<0.01)；當(dāng)超過0.5水平后(425 U/g、47.5℃)，二者的交互作用對(duì)石莼可溶性糖提取率Y的影響呈極顯著(P<0.01)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)兩因素均處于較低水平時(shí)，由于纖維素酶使用量太少，底物與酶作用不充分，原料中的纖維素得不到充分降解，影響可溶性成分的釋放與溶出；加之超聲提取溫度較低，提取液中分子的運(yùn)動(dòng)速度緩慢，不利于可溶性成分從細(xì)胞內(nèi)溶出，故石莼可溶性糖提取率Y較低，當(dāng)二因素的水平同時(shí)提高時(shí)，不僅更多的底物被酶作用，酶解反應(yīng)速度加快，而且反應(yīng)體系分子運(yùn)動(dòng)速度也加快，溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)增大[8-9]，二者的協(xié)同增效作用使得可溶性成分的提取率極顯著(P<0.01)提高；但當(dāng)二因素均超過一定水平后，由于樣品中的纖維素已基本被降解，此時(shí)繼續(xù)增加酶使用量，對(duì)石莼可溶性糖的提取率Y的提高作用不大；而超聲提取溫度偏高，酶被鈍化，導(dǎo)致酶的活性降低甚至喪失，酶促反應(yīng)受到明顯抑制[10]，兩因素綜合的結(jié)果導(dǎo)致對(duì)石莼可溶性糖提取率的影響呈現(xiàn)極顯著的負(fù)作用。

圖3顯示，當(dāng)纖維素酶使用量X1和超聲提取時(shí)間X4固定在0水平時(shí)，提取料液比X2與超聲提取溫度X3的交互作用對(duì)石莼可溶性糖提取率Y有顯著影響(P<0.05)。當(dāng)提取料液比X2、超聲提取溫度X3均處于-2(1∶20，35℃)至0.5(1∶32.5，47.5℃)水平范圍內(nèi)，二者對(duì)石莼可溶性糖提取率Y的影響呈極顯著(P<0.05)的正相關(guān)交互作用。但當(dāng)二因素均超過0.5(1∶32.5，47.5℃)水平時(shí)，兩因素對(duì)石莼可溶性糖的提取率Y呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)影響(P<0.05)。

在一定范圍內(nèi)，提取溫度的提高，會(huì)加快酶解反應(yīng)的速度及擴(kuò)散速度，提高可溶性成分的溶解度和滲透能力；而適當(dāng)提高料液比，可使細(xì)胞內(nèi)部可溶性成分與溶劑間的濃度差增大，亦有利于可溶性成分的浸出[11-12]；所以當(dāng)二者同時(shí)增大時(shí)，提取料液比和超聲提取溫度對(duì)石莼可溶性糖的提取起協(xié)同增效作用，其提取率顯著(P<0.05)提高；但當(dāng)二因素均超過一定水平時(shí)，過多的提取溶劑對(duì)酶的濃度造成稀釋，同時(shí)偏高的提取溫度可破壞酶的活性中心，使其部分甚至全部失去催化活性，降低酶解反應(yīng)速度，兩因素的綜合結(jié)果使石莼可溶性糖的提取率Y呈顯著(P<0.05)下降趨勢(shì)。

由圖4可知，當(dāng)纖維素酶使用量X1和提取料液比X2固定在0水平時(shí)，超聲提取溫度X3與超聲提取時(shí)間X4的交互作用對(duì)石莼可溶性糖提取率Y有極顯著影響(P<0.01)。在-2(35℃、0.5 h)至0.5(47.5℃、1.75 h)水平范圍內(nèi)，超聲提取溫度X3與超聲提取時(shí)間X4的交互作用對(duì)石莼可溶性糖提取率Y的影響呈極顯著(P<0.01)的正相關(guān)交互關(guān)系；當(dāng)二因素均大于0.5(47.5℃、1.75 h)水平時(shí)，二者對(duì)石莼可溶性糖提取率呈顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)交互關(guān)系。在一定的水平范圍內(nèi)，超聲溫度越高，時(shí)間越長，越有利于破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)內(nèi)部可溶性成分的溶出，從而可極顯著地提高可溶性成分的提取率(P<0.01)[13]；但溫度偏高，酶活部分甚至全部喪失，酶促反應(yīng)受到明顯抑制；而超聲提取時(shí)間足夠長時(shí)，擴(kuò)散已達(dá)到平衡，可溶性糖已基本溶出，這時(shí)再延長時(shí)間，對(duì)可溶性糖的提取作用不大，兩因素的綜合結(jié)果，過高超聲提取溫度的負(fù)作用占主導(dǎo)性，因此石莼可溶性糖的提取率反而下降。

2.2.3 工藝參數(shù)優(yōu)化及擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

為獲得最佳的工藝參數(shù)組合，通過DPS進(jìn)行頻率分析法尋優(yōu)[14]，其中石莼可溶性糖提取率大于11.65%的方案有29個(gè)。在95%的置信區(qū)間內(nèi)，頻數(shù)分析結(jié)果見表4。

由表4可知，石莼可溶性糖提取最佳工藝參數(shù)組合范圍：纖維素酶使用量416.75～433.45 U/g、提取料液比1∶31.51～1∶34.83、超聲提取溫度46.86～48.67℃、超聲提取時(shí)間1.64～2.02 h，在此參數(shù)范圍內(nèi)，石莼可溶性糖提取率均大于11.65%。取優(yōu)化后工藝參數(shù)的平均值，結(jié)合考慮實(shí)際操作，得到修正后的超聲波輔助酶提取石莼可溶性糖最佳工藝參數(shù)組合為纖維素酶使用量430 U/g，提取料液比1∶30，超聲提取溫度50℃，超聲提取時(shí)間1.5 h。

按照上述優(yōu)化工藝參數(shù)組合，結(jié)合其他單因素的理想?yún)?shù)水平進(jìn)行3次擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)，得到石莼可溶性糖的提取率的平均值為12.02%，與理論值12.08%無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P>0.05)，進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)學(xué)回歸模型的合理性。

表4 各變量取值頻率分布

2.3 石莼功能性寡糖的制備

鑒于石莼可溶性糖粗提液中夾雜有許多的多糖及可溶性蛋白質(zhì)等，利用寡糖易溶于乙醇，而多糖、可溶性蛋白質(zhì)不溶于乙醇的特點(diǎn)，采用醇沉法將功能性寡糖與多糖、蛋白質(zhì)分離。為了節(jié)約乙醇的使用量，將上述提取得到的石莼可溶性糖粗提液真空濃縮(真空度0.095 Mpa、溫度55℃)至原體積的10%～15%后，加入石莼可溶性糖濃縮液4倍體積的無水乙醇，于冰箱靜置24 h沉淀，以去除多糖、蛋白質(zhì)。收集上清液，再經(jīng)真空濃縮去除乙醇，冷凍干燥(真空度1.2 pa、溫度-60℃、時(shí)間12 h)制得石莼功能性寡糖，經(jīng)計(jì)算，石莼功能性寡糖的提取率為2.38%。

3 結(jié)論

本研究采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法實(shí)施試驗(yàn)，優(yōu)化超聲輔助酶法提取石莼功能性寡糖關(guān)鍵工藝。

1)建立了石莼可溶性糖提取率Y與纖維素酶使用量X1、提取料液比X2、超聲提取溫度X3、超聲提取時(shí)間X4的數(shù)學(xué)回歸方程：

方差分析顯示，該數(shù)學(xué)方程回歸極顯著，失擬不顯著，與實(shí)際情況擬合較好，能夠較好地反映實(shí)際操作中纖維素酶使用量、提取料液比、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間對(duì)石莼可溶性糖提取率的影響。

采用Design Expert軟件進(jìn)行分析，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的操作方便性，獲得經(jīng)校正的超聲波輔助纖維素酶提取石莼可溶性糖的關(guān)鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化組合為纖維素酶添加量430 U/g、提取料液比1∶30、超聲提取溫度50℃、超聲提取時(shí)間1.5 h，以此為條件結(jié)合其他單因素試驗(yàn)的理想?yún)?shù)水平進(jìn)行擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)，石莼可溶性糖的提取率為12.02%，與理論預(yù)測(cè)值12.08%無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2)將石莼可溶性糖提取液經(jīng)濃縮、采用醇沉去除多糖、蛋白質(zhì)后，石莼功能性寡糖的提取率為2.38%。