MMP-9抑制劑對大鼠腦出血模型腦水腫程度的影響及其對血腦屏障的作用

顧云鶴,張默嶠,王宏達(dá),方 想

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科,黑龍江 哈爾濱150000)

腦出血(cerebral hemorrhage，CH)是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂而引起的出血，約占全部腦卒中的20%-30%，急性期病死率為3成以上，早期死亡率很高，腦出血發(fā)生的機(jī)制主要與腦血管的病變有關(guān)。腦出血后的腦水腫及血腦屏障的破壞均是腦出血并發(fā)癥中較為嚴(yán)重的。越來越多的文獻(xiàn)研究表明[1]，腦出血后的腦水腫、神經(jīng)損傷以及血腦屏障的破壞與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)有關(guān)。因此本研究基于以往的研究成果，探究MMP-9抑制劑對于腦出血后神經(jīng)系統(tǒng)損傷、腦水腫以及血腦屏障破壞的影響作用，為腦出血并發(fā)癥的預(yù)防研究做出一定的貢獻(xiàn)?，F(xiàn)采用大鼠進(jìn)行模擬試驗，實驗報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取成年雄性Wistar大鼠共計70只，體重范圍為250-300 g，實驗用大鼠由我院動物實驗中心提供。實驗設(shè)置對照組、實驗組、用藥組，對照組共用7只大鼠，實驗組及用藥組各28只大鼠，實驗組及用藥組分別于12 h、24 h、3 d、5 d等時間點(diǎn)分成4個亞組，每個亞組7只大鼠，另7只大鼠作為備用補(bǔ)充用。

1.2 研究方法

1.2.1造模

實驗組造模：取成年Wistar大鼠28只，10%水合氯醛(0.3 g/kg,Sigma-Aldrich,St.Louis，MO,USA)腹腔注射麻醉，麻醉后頭部及股部備皮，酒精消毒；在操作臺上切開右股部皮膚，切口10 mm，分離肌肉、神經(jīng)，暴露股動脈后固定在立體定位儀上。大鼠門齒放在立體定位儀的前桿上，把兩側(cè)固定桿的螺紐旋松，將固定棒向兩側(cè)拉開，大鼠頭部放在兩側(cè)固定桿之間，先將一側(cè)固定桿固定于大鼠外耳道旁小凹處，再將另一側(cè)固定桿固定于另一側(cè)外耳道旁小凹處，兩側(cè)旋緊，緊固大鼠腦部，調(diào)動兩側(cè)固定棒，使左右讀數(shù)相同。將大鼠頭部抬起，使兩側(cè)外耳道中心與外眥的連線與放置定位儀的桌面平行。在立體定向儀的平臺上墊一泡沫板(以減小平臺鋼板對大鼠體溫的影響)。頭部正中切開皮膚，長約10 mm，3%雙氧水剝蝕骨膜，暴露前后囟。于前囟前0.02 mm，中線右側(cè)旁開3.0 mm處鉆一直徑約1 mm 的小孔，不傷及硬腦膜及腦組織。利用立體定向儀立體定位大鼠的紋狀體(前囟前0.2 mm,側(cè)3 mm,深6 mm)，微量注射器向紋狀體內(nèi)注入0.5單位的VII型膠原酶(0.5U 溶于1.0 μl無菌生理鹽水,Sigma-Aldrich)，注射時緩慢，約需5 min，注射完畢后不要立即拔針，繼續(xù)留針10 min后緩慢退針，后骨蠟填充鉆孔，生理鹽水沖洗干凈后縫合傷口。手術(shù)過程中從大鼠股動脈抽取300 μl動脈血進(jìn)行血?dú)夥治龊脱Ｒ?guī)，包括pH值、氧分壓、二氧化碳分壓、血糖和血紅蛋白。

對照組造模：利用立體定向儀向紋狀體內(nèi)注入1.0 μl的生理鹽水，操作方法同上。

用藥組造模：按實驗組方法造模后，立即腹腔注射MMP-9拮抗劑(GM6001，Millipore)25 mg/kg體重。

1.2.2數(shù)據(jù)測定

腦組織形態(tài)學(xué)觀察：分別于各觀察時點(diǎn)對大鼠麻醉后快速斷頭取出腦組織，于大鼠腦出血病灶行冠狀位切開，于腦出血位置周圍2 mm為厚度取腦組織作為標(biāo)本，取10%甲醛對標(biāo)本進(jìn)行固定、脫水及包埋處理，處理過后的標(biāo)本在 石蠟切片機(jī)下進(jìn)行5 μm厚度的切片[2]，之后對切片進(jìn)行脫蠟處理以及HE染色，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行切片腦組織進(jìn)行觀察。

神經(jīng)組織損傷檢測：取各組大鼠的腦組織石蠟切片，對切片進(jìn)行TUNEL法染色，染色后觀察切片中腦組織是否存在凋亡現(xiàn)象，其中判定腦組織細(xì)胞凋亡是以細(xì)胞胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為準(zhǔn)。隨機(jī)于400倍鏡下抽取5片切片觀察并記錄凋亡細(xì)胞數(shù)量。

腦水腫測定：采用干濕重法測量腦水腫。深度麻醉下將大鼠斷頭處死，快速完整的剝離出腦組織。用鋒利的刀片在注射點(diǎn)前后2 mm冠狀切割，獲得4 mm厚的冠狀腦片，將兩側(cè)半球的皮質(zhì)和紋狀體分離下來，分別稱取重量作為濕重，用錫紙包好雙側(cè)的紋狀體和皮質(zhì)，做好標(biāo)記，放入烤箱內(nèi)100℃下烘烤24 h，再次稱量作為干重。計算腦水腫的公式為[(濕重-干重)/濕重]×100%。

血腦屏障通透性測定：大鼠處死前2 h靜脈注射依文思藍(lán)染料(2%溶于生理鹽水中，4 mL/kg)，可觀察到大鼠結(jié)膜、齒齦、四肢末梢和尾部等處均呈藍(lán)色，依文思藍(lán)染料在體內(nèi)循環(huán)2 h后，過量水合氯醛麻醉(0.5 g/kg)。灌注針從大鼠的左心室插入，避免破入到右心，并用止血鉗固定好。剪破右心耳，從大鼠左心室緩慢持續(xù)的灌注250 ml生理鹽水去除腦血管內(nèi)殘留的血液，直至從右心耳流出清亮的液體。斷頭殺死大鼠，快速取出出血側(cè)腦半球組織，用生理鹽水沖洗腦表面以減少血跡及雜質(zhì)對吸光度值的影響。取損傷側(cè)腦半球組織稱重記錄，并放入到甲酰胺(1 mL/100 mg)中37℃放置48 h。離心后取上清用分光光度計在620 nm下測量上清液的吸光度值。用倍比稀釋法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,在標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上將得到的吸光度值換算為依文思藍(lán)染料的含量以評價血腦屏障的通透性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織形態(tài)情況

觀察得出，對照組大鼠顱腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)組織等排列整齊，細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)染色均勻，染色后胞漿顏色為淡紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色。其中實驗組大鼠大腦皮層神經(jīng)纖維組織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常紊亂，排列不規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化且部分神經(jīng)細(xì)胞有凋亡的情況出現(xiàn)，細(xì)胞核存在固縮和溶解現(xiàn)象，細(xì)胞體積減小，胞質(zhì)凝集等，實驗組大鼠以上變化以造模后12 h時表現(xiàn)最為明顯，之后隨著時間延長，癥狀出現(xiàn)減輕。用藥組大腦皮層神經(jīng)纖維組織出現(xiàn)輕微的結(jié)構(gòu)異常紊亂，出現(xiàn)較輕度的結(jié)構(gòu)變化，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象存在，但數(shù)目遠(yuǎn)低于實驗組，細(xì)胞核仍有固縮和溶解的情況存在，但程度較實驗組低，且隨著造模時間的延長，用藥組于造模12 h后的恢復(fù)速度也較實驗組快。選取各組各時間段腦組織示例圖片如圖1-7所示。

1 對照組，2 實驗組12 h，3 實驗組24 h，4 實驗組3 d，5 用藥組12 h，6 用藥組24 h，7 用藥組3 d

2.2 各組神經(jīng)組織凋亡情況

各組石蠟切片經(jīng)TUNEL染色后進(jìn)行觀察。三組在各時段方差分析后，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.920,10.271,9.736,12.992，P=0.000,0.000,0.000,0.000),對照組大鼠的石蠟切片中偶可發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞存在，實驗組石蠟切片中的凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量在各時間段均高于對照組，實驗組與對照組兩兩比較各時段均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；用藥組石蠟切片中的凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量在各時間段均低于實驗組，用藥組與實驗組組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。具體情況如下表1所示。

表1 各組神經(jīng)組織凋亡情況

注：*與對照組相比，P<0.05；#與實驗組相比，P<0.05。

2.3 各組腦水腫情況

各組進(jìn)行腦組織含水量檢測。三組在各時段方差分析后，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.652,8.663,7.756,10.726，P=0.000,0.000,0.000,0.000)；實驗組大鼠的腦組織含水量在各時間段均高于對照組，其中以造模后12 h含水量最多，實驗組與對照組組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；用藥組腦組織含水量在各時間段均低于實驗組，用藥組與實驗組組間組間兩兩比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體情況如下表2所示。

表2 各組腦水腫情況

注：*與對照組相比，P<0.05；#與實驗組相比，P<0.05。

2.4 各組血腦屏障通透性情況

各組進(jìn)行血腦屏障通透性檢測，在大腦皮層依文思藍(lán)濃度和基底節(jié)區(qū)依文思藍(lán)濃度方面，三組各時段經(jīng)過方差分析后，大腦皮層依文思藍(lán)濃度方面(F=12.726,14.726,13.827,11.726，P=0.000,0.000,0.000,0.000)，基底節(jié)區(qū)依文思藍(lán)濃度方面(F=15.262,11.223,12.736,10.928，P=0.000,0.000,0.000,0.000)，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組大鼠大腦皮層及基底節(jié)區(qū)血腦屏障通透性在各時間段均高于對照組，其中以造模后12h大腦皮層及基底節(jié)區(qū)血腦屏障通透性最高，實驗組與對照組兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；用藥組大腦皮層及基底節(jié)區(qū)血腦屏障通透性在各時間段均低于實驗組，用藥組與實驗組兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體情況如下表3所示。

表3 各組腦水腫情況比較

注：*與對照組相比，P<0.05；#與實驗組相比，P<0.05。

3 討論

由于目前人們生活水平的提高，血脂、血壓及血糖等都呈現(xiàn)上升趨勢，而這些恰恰都是腦出血的高危因素，因此導(dǎo)致腦出血發(fā)病率也在逐年上升。其中腦出血后主要危險因素就是腦水腫的出現(xiàn)，有文獻(xiàn)研究表明，腦出血后的血腫可以刺激大量的MMP-9出現(xiàn)，MMP-9在正常人大腦中的含量極少，但是一旦出現(xiàn)腦出血，MMP-9的含量就會極速上升[3]。小劑量的MMP-9對腦組織、神經(jīng)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，可以對腦水腫的擴(kuò)大起到減速的作用，但是大劑量的MMP-9則會對水腫的產(chǎn)生以及神經(jīng)細(xì)胞和腦細(xì)胞的破壞起到加速作用，進(jìn)而擴(kuò)大水腫的面積[4]。因此目前對于MMP-9的抑制就成為了控制腦出血后腦水腫的新思路。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖(Dystroglycan,DG)在膠質(zhì)細(xì)胞終突大量表達(dá)，被認(rèn)為是維持血腦屏障一個重要條件[5]。血腦屏障是保護(hù)腦組織微環(huán)境及神經(jīng)元免受血液中成分干擾的重要結(jié)構(gòu)。血腦屏障是個動態(tài)的結(jié)構(gòu)，可被多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病改變，如腦卒中[6]。 腦出血后，血腦屏障被破壞，血腫周圍水腫在3 h至14 d內(nèi)可持續(xù)增加，是腦出血后致殘致死的重要病理基礎(chǔ)[7]。越來越多的研究表明，腦出血后血腦屏障的破壞與MMP，尤其是MMP-9密切相關(guān)，但MMP-9通過何種途徑破壞BBB目前尚不清楚[8]?；谏鲜鲅芯窟M(jìn)展[9]，實驗者設(shè)想腦出血后，血腫周圍水腫帶中，細(xì)胞外基質(zhì)受體DG表達(dá)如何改變，血腦屏障破壞及血腫周圍水腫形成同MMP-9含量間的關(guān)系等，這些機(jī)制目前國內(nèi)外尚無報道[10]。希望通過腦出血后血腦屏障破壞或腦水腫發(fā)生的機(jī)制研究，對今后腦出血治療及預(yù)后提供新的臨床思路。

本研究結(jié)果表明，實驗組大鼠腦組織形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，相神經(jīng)細(xì)胞排列出現(xiàn)紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象，且細(xì)胞核出現(xiàn)了固縮和溶解，而用藥組在使用了MMP-9抑制劑后對以上細(xì)胞損傷情況明顯減輕，結(jié)果表明MMP-9抑制劑對腦組織及神經(jīng)有一定的保護(hù)作用，且用藥組凋亡數(shù)目少于實驗組，也證明了其保護(hù)作用。MMP-9抑制劑可以降低血腦屏障的通透性，降低腦水腫的出現(xiàn)，說明其對腦出血的進(jìn)一步發(fā)展起到一定的抑制作用。

綜上所述，MMP-9抑制劑對腦出血后大鼠的腦神經(jīng)、腦組織損傷起到一定控制作用，減輕腦出血后的腦水腫發(fā)展以及血腦屏障通透性的增高，對于控制腦出血以及減輕腦出血并發(fā)癥起到了較好的控制作用。由于目前研究局限于大鼠，并沒有實際應(yīng)用到臨床，但本研究可以為MMP-9抑制劑在臨床腦出血的應(yīng)用方面起到一定的參考作用，我們也會繼續(xù)完善我們的研究，爭取早日應(yīng)用于臨床。