復(fù)方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷的高效液相色譜法含量檢測(cè)

周寶玉 虞文妹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院中藥房，南京，213161)

復(fù)方魚腥草膠囊是近年來(lái)《中華人民共和國(guó)藥典》新增加的中藥復(fù)方制劑，臨床生產(chǎn)和使用量較大，有多家廠家獲得復(fù)方魚腥草膠囊的生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)，復(fù)方魚腥草膠囊的主要藥物組成及比例為魚腥20：草板藍(lán)根5：黃芩5：連翹2：金銀花2，該方主要用于治療具有風(fēng)熱證候表現(xiàn)，因外感風(fēng)熱而起咽喉疼痛、急性扁桃體炎、急性咽炎等病癥，全方以魚腥草為君藥清熱解毒，以黃芩、板藍(lán)根為臣藥，清熱瀉火、燥濕涼血、解毒利咽，以連翹和金銀花為佐使，助君臣清散風(fēng)熱，涼血解毒之功[1-2]。目前關(guān)于復(fù)方魚腥草膠囊的文獻(xiàn)報(bào)道較少，有研究顯示高效液相色譜法(HPLC)分析發(fā)現(xiàn)魚腥草中藥理活性較多[3-4]，有研究復(fù)方魚腥草合劑中薄層色譜法(TLC)研究金銀花的主要成分綠原酸并測(cè)定其含量[5]，然對(duì)該方中主要藥物的連翹和黃芩，目前的報(bào)道研究較少，基于此，本課題組以測(cè)定連翹苷和黃芩苷為主要研究指標(biāo)，檢測(cè)復(fù)方魚腥草膠囊中二者的含量，以滿足患者不同服藥需求，現(xiàn)將復(fù)方魚腥草膠囊HPLC研究詳細(xì)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 沃特世高效液相色譜儀2695，沃譜達(dá)儀器(蘇州)有限公司);外校電子精密天平(梅特勒ML802，蘇上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司);TQC薄層板涂布器(VF2161，上海諾彩貿(mào)易有限公司)

1.2 試劑 色譜HPLC甲醇，色譜HPLC冰醋酸、色譜HPLC乙腈、色譜HPLC磷酸和色譜HPLC無(wú)水乙醇均購(gòu)于上海展云化工有限公司;中國(guó)食品藥品檢定研究院提供的超純水、連翹苷對(duì)照品(批號(hào)-110821-201514)和黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)-0715-9909)。

1.3 分析樣品 隨機(jī)選取2個(gè)不同廠家生產(chǎn)的樣品1：復(fù)方魚腥草膠囊(云南云龍制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20055662)；樣品2：復(fù)方魚腥草膠囊(安徽威爾曼制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050708)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用ACQUITY-BEHP-henyl-C18保護(hù)柱(5 μm)，以室內(nèi)溫度為柱溫，進(jìn)樣量為20 μL以乙腈為流動(dòng)相A，以水+0.02%磷酸為流動(dòng)相B，流速1.0 mL/min：檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 首先將連翹苷對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品放置于60 ℃真空干燥至恒重，然后分別精密稱取10.3、5.3 mg于50 mL量瓶中，連翹苷對(duì)照品瓶加入50%甲醇適量，黃芩苷對(duì)照品瓶加入無(wú)水乙醇適量，均超聲溶解，混合均勻后制成連翹苷對(duì)照品溶液(0.206 mg/mL)和黃芩苷對(duì)照品溶液(含黃芩苷0.106 mg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方魚腥草膠囊的內(nèi)容物3.0 g于20 mL的錐形瓶中并加入適量甲醇，采用軟木塞塞緊瓶口，充分混合均勻后記錄重量，超聲處理(功率500 W)30 min后，待溶液冷區(qū)后記錄重量，比較2次重量，計(jì)算重量差并以甲醇補(bǔ)齊至等重，采用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾混合液制成供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液，采用HPLC對(duì)復(fù)方魚腥草膠囊中連翹、黃芩等進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示如圖1和圖2，復(fù)方魚腥草膠囊中連翹和黃芩專屬性良好。

圖1 連翹專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖

圖2 黃芩專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取連翹苷、黃芩苷對(duì)照品的甲醇溶液3.0、6.0、12.0、18.0、24.0 mL，分別置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取10 μL，采用HPLC，記錄峰面積；以對(duì)照品進(jìn)樣量(μ g)為橫坐標(biāo)(X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，連翹苷回歸方程Y=98 009X-86650，r=0.999 2(n=5)，結(jié)果表明，連翹苷對(duì)照品在3.23～103.02 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；黃芩苷回歸方程Y=212 284X+108 806，r=0.999 8(n=5)，結(jié)果表明，黃芩苷對(duì)照品在2.74～87.89 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)注偏差RSD是1.13%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 在室溫下精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、1、4、8、10、12、24 h后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示24 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定，RSD是1.35%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測(cè)5次，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.20%，重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取5份已知含量的同一批號(hào)樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對(duì)照品甲醇溶液(0.005 36 mg/mL)，進(jìn)行回收率試驗(yàn)測(cè)定，計(jì)算結(jié)果顯示平均回收率為99.07%，RSD為0.75%。見表1和表2。

表1 連翹苷回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2 黃芩苷回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.1 薄層色譜法鑒別連翹苷和黃芩苷 將制成的對(duì)照品和供試品溶液分別吸取5 μL滴于硅膠G薄層板上，在展開劑23醋酸丁酯:8甲酸:7水的作用下，經(jīng)365 nm的紫外燈觀察發(fā)現(xiàn)連翹苷和黃芩苷在陰性對(duì)照品位置上相互之間不存在干擾現(xiàn)象。見圖3。

圖3 復(fù)方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷的鑒別

注：1.金銀花、魚腥草雙陰性對(duì)照品，2.黃芩陰性對(duì)照品，3～5復(fù)方魚腥草膠囊，6.連翹苷，7.黃芩苷

2.10.2 高效液相色譜分析連翹苷和黃芩苷含量 在每批樣品做3次重復(fù)研究取平均值后，結(jié)果顯示2個(gè)樣品中連翹苷和黃芩苷的含量和RSD值均差不多，具體數(shù)值如表3所示。

表3 復(fù)方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化 在分離連翹藥材中的連翹苷和黃芩藥材中的黃芩苷的HPLC研究中，實(shí)驗(yàn)室流動(dòng)相優(yōu)化研究中，分別以水-甲醇、水-乙腈，乙腈-0.01%磷酸，乙腈-0.02%磷酸，乙腈-0.03%磷酸等不同的流動(dòng)相進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)反復(fù)數(shù)次的研究后，發(fā)現(xiàn)室內(nèi)溫度為柱溫，進(jìn)樣量為20 μL時(shí)，以乙腈為流動(dòng)相A，以水+0.02%磷酸為流動(dòng)相B，流速1.0 mL/min：連翹苷和黃芩苷的分離度最大，能夠滿足后續(xù)研究中連翹苷和黃芩苷的定量測(cè)定，由此本研究最終選擇的流動(dòng)相是乙腈-0.02%磷酸。

3.2 專屬性試驗(yàn)的重要性 本研究復(fù)方魚腥草膠囊由五味藥組成，制訂了HPLC色譜法鑒別研究其專屬性進(jìn)行定性質(zhì)量評(píng)價(jià)；本研究的目的是檢查復(fù)方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷的含量，而復(fù)方魚腥草膠囊藥味多，藥性復(fù)雜，在有其他成分存在的可能情況下，如果連翹苷和黃芩苷這2個(gè)需要檢測(cè)的成分不具有專屬性，那么在后續(xù)的含量檢測(cè)中則可能因?yàn)殡s質(zhì)的影響而造成偏差。假如在專屬性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)含有雜質(zhì)，那么在雜質(zhì)可獲得的情況下，可以采用加入雜質(zhì)到待測(cè)樣品于未加入雜志的待測(cè)樣品進(jìn)行比較，考察雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)成分含量測(cè)定是否存在干擾性[6-8]。基于前期研究條件如精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、線性考察和樣品回收率等方法的反復(fù)試驗(yàn)調(diào)整了最佳HPLC色譜條件，顯示多元指紋圖譜是一種方法簡(jiǎn)便，且具有高靈敏度、高重復(fù)性和較強(qiáng)的專屬性強(qiáng)的一種研究方法[9-12]；本研究結(jié)果HPLC色譜圖顯示復(fù)方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷的專屬性良好。

3.3 薄層色譜法與HPLC結(jié)合進(jìn)行復(fù)方魚腥草膠囊含量檢測(cè)的意義 薄層色譜法(TLC)以涂布于硅膠板、玻璃板等支持劑上作為固定相并形成一個(gè)均勻的薄層，加入合適的展開劑作為其流動(dòng)相，對(duì)樣品具有分離、鑒別和定量的功能[13-17]，由于TLC對(duì)生物高分子的分離效果不夠理想[18-19]，因此在定量性研究中，目前的主流研究方法是采用HPLC進(jìn)行[20-21]，本研究采用TLC與HPLC 2種方法相結(jié)合的方式，對(duì)復(fù)方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷進(jìn)行含量檢測(cè)。復(fù)方魚腥草膠囊的清熱解毒功效好，它是植根于深厚的中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論基礎(chǔ)，同時(shí)結(jié)合豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)而被研發(fā)出來(lái)的中藥復(fù)方制劑，在當(dāng)今存在“抗生素類藥物濫用”的情況下，《中華人民共和國(guó)藥典》收錄復(fù)方魚腥草膠囊的這一舉措，關(guān)注及肯定復(fù)方魚腥草膠囊在臨床的廣泛適用性和部分替代抗生素的治療價(jià)值的。研究中為控制復(fù)方魚腥草膠囊的藥物質(zhì)量的安全性，在對(duì)連翹苷和黃芩苷含量檢測(cè)之前，首先采用薄層色譜法結(jié)合處方藥味所含化學(xué)成分及藥理學(xué)活性，對(duì)連翹中的連翹苷、黃芩中的黃芩苷等進(jìn)行了定性鑒別，研究結(jié)果顯示3批不同的測(cè)試樣本的色譜斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，空白均無(wú)出現(xiàn)干擾；接著應(yīng)用多元指紋圖譜分析測(cè)定了復(fù)方魚腥草膠囊制劑中連翹苷、黃芩苷的含量，本研究結(jié)果顯示樣品1連翹苷含量0.51 mg，RSD為1.72%，黃芩苷含量14.6 mg，RSD為4.95%；而樣品2連翹苷0.50 mg，RSD為1.69%，黃芩苷含量14.3 mg，RSD為4.92%；2組復(fù)方魚腥草膠囊樣品中連翹苷和黃芩苷的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。