甘蔗脫毒健康種苗中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的差異表達(dá)分析

趙婷婷 王俊剛 楊本鵬 沈林波 馮小艷 王文治 馮翠蓮 熊?chē)?guó)如 張樹(shù)珍

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?71101）

植物中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sucrose transporter，SUT）是一種蔗糖/H＋共轉(zhuǎn)運(yùn)體，具備典型的12跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于易化擴(kuò)散超家族（Major facilitator superfamily，MFS），利用H＋-ATP泵在細(xì)胞內(nèi)外建立質(zhì)子濃度梯度，進(jìn)行蔗糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［1］。植物中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因首先從菠菜中分離得到［2］，隨后在多種植物中分離出蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因［3］，并進(jìn)一步通過(guò)爪蟾卵母細(xì)胞電生理或酵母功能缺失突變體驗(yàn)證SUTs蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性［4-6］。SUT基因家族可聚類(lèi)為3個(gè)亞族：SUT1、SUT2和SUT4，并在植物體內(nèi)碳同化物運(yùn)輸和積累中發(fā)揮重要作用［7-8］。

SUT1亞族分布于成熟葉的各級(jí)葉脈、莖及多種“庫(kù)”器官，在韌皮部蔗糖的裝載、卸載、運(yùn)輸途徑中蔗糖分子的重吸收及維持濃度梯度等方面都可能發(fā)揮重要作用［9-11］。SUT2亞族受蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)合SUT2低水平的密碼子偏好性和獨(dú)特的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)等推測(cè)，其可能是質(zhì)膜蔗糖信號(hào)感應(yīng)元件，影響蔗糖積累［12］；SUT4亞族是定位在液泡膜上的一種H+/蔗糖同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要進(jìn)行液泡內(nèi)的蔗糖輸出，維持庫(kù)端滲透壓，有利于蔗糖的進(jìn)一步積累［13-17］。不同類(lèi)型蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育和蔗糖積累的不同階段所起作用不同，與植物的生物量形成和蔗糖含量的關(guān)系密切［6，18］。

植物通過(guò)葉片光合作用生產(chǎn)的糖類(lèi)分子是其自身代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些糖類(lèi)分子部分用于植物生長(zhǎng)發(fā)育，部分在不同器官間進(jìn)行分配和儲(chǔ)存。蔗糖是甘蔗葉光合作用的主要產(chǎn)物，也是碳水化合物運(yùn)輸?shù)闹饕问?，同時(shí)也是甘蔗莖稈中糖分利用和積累的主要形式。由于蔗糖在長(zhǎng)距離運(yùn)輸過(guò)程中涉及多次跨膜運(yùn)輸，因此，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)和積累中起重要作用。

甘蔗是多年生宿根無(wú)性繁殖作物，經(jīng)多年連續(xù)宿根和無(wú)性留種生產(chǎn)后，多種病原物反復(fù)侵染并在甘蔗體內(nèi)積累，抑制甘蔗正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致優(yōu)良品種種性退化，造成甘蔗減產(chǎn)達(dá)10%，有的甚至高達(dá)50%［19-20］。目前脫毒健康種苗生產(chǎn)技術(shù)是恢復(fù)甘蔗優(yōu)良種性最有效的技術(shù)措施，種植甘蔗脫毒健康種苗可以增產(chǎn)20%-40%［21-23］。從甘蔗農(nóng)藝性狀上對(duì)其增產(chǎn)增糖機(jī)理已開(kāi)展較詳細(xì)的研究［22，24］，但更進(jìn)一步從蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)方面對(duì)其增產(chǎn)增糖的機(jī)理研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用已報(bào)道的3個(gè)甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SUT1、SUT4和SUT6為研究對(duì)象，分別從甘蔗整個(gè)生長(zhǎng)期（苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期）對(duì)它們的表達(dá)量進(jìn)行比較分析，探討經(jīng)過(guò)脫毒處理后蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)量與增產(chǎn)增糖之間的相關(guān)性，從分子水平上揭示甘蔗脫毒健康種苗的增產(chǎn)增糖機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甘蔗新臺(tái)糖22號(hào)品種腋芽脫毒種苗二代種莖苗和普通新臺(tái)糖22號(hào)種莖（對(duì)照），來(lái)源于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所甘蔗試驗(yàn)地。RNA提取試劑盒購(gòu)自Aidlab（艾德萊）公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；測(cè)序載體、T4連接酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；DNA Marker和核酸染料購(gòu)于上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)和管理 田間試驗(yàn)地點(diǎn)在海南省臨高縣皇桐鎮(zhèn)甘蔗試驗(yàn)基地進(jìn)行。土壤為紅壤、肥力中等。采用隨機(jī)區(qū)組排列，設(shè)2個(gè)處理，分別種植脫毒種苗和普通種苗，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。株距為0.5 m，行距1.2 m，5行區(qū)，每行長(zhǎng)10.0 m，小區(qū)試驗(yàn)面積60 m2，每行下種20段雙芽苗，3面設(shè)保護(hù)行。田間管理參照文獻(xiàn)［22］的方法進(jìn)行。

1.2.2 樣品采集 分別選取10個(gè)生長(zhǎng)一致的試驗(yàn)植株，在苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期進(jìn)行取樣，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)，甘蔗未成熟葉片為0葉，成熟葉片為+3葉，莖稈節(jié)段的計(jì)算是生長(zhǎng)點(diǎn)向下計(jì)算甘蔗莖節(jié)數(shù)，拔節(jié)期分別?。?-3、4-5和7-8、10-11、13-14、16-17、19-20和 22-23莖節(jié)），成熟期分別取幼莖（1-3、4-5和7-8、10-11、13-14、16-17、19-20、22-23、29-30 和 36-37 莖節(jié)）。

1.2.3 總RNA提取、檢測(cè)與反轉(zhuǎn)錄 參照王俊剛等［25］方法進(jìn)行甘蔗總RNA提取和檢測(cè)。cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，各材料起始總RNA模板用量一致。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI公布的甘蔗轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SUT1（GenBank登錄號(hào)AY780256.1）和SUT4（GenBank登錄號(hào)GQ485583.1）序列利用Primer5設(shè)計(jì) 引 物（SUT1-F ：5′-GTTCCTGCTACCCAAGAT-3′，SUT1-R ：5′-CCTCTTCTTATTCTGTTCAA-3′；SUT4-F ：5′-GCCCAGACAACCCAGGAGAGAC-3′，SUT4-R：5′-CAGAGGTGAATCCAAGGACGACAG-3′）；SUT6引物參照Z(yǔ)hang等［26］方法設(shè)計(jì)（SUT6-F：5′-CATGGTCGTCTGATCGATGTT-3′，SUT6-R ：5′-ACCACAAATCCGGCGATAG-3′）， 內(nèi) 參GADPH引物參考 Iskandar等［27］方法設(shè)計(jì)（GAPDH-F：5′-CACGGCCACTGGAAGCA-3′，GAPDH-R ：5′-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3′）。

1.2.5 qPCR 擴(kuò) 增 參 照 SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重 復(fù)，qPCR反 應(yīng) 體 系 ：2×SYBRPremixExTaqTM10 μL、上下游引物（濃度為 4 μmol/L）各 2 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、 模 板 cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序?yàn)樵噭┖型扑]程序，并在Mx3005PTM（Roche）上完成擴(kuò)增。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)定量值［28］。內(nèi)參基因?yàn)楦收酖ADPH。

2 結(jié)果

2.1 RNA純度鑒定結(jié)果

甘蔗總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S和18S條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯降解現(xiàn)象；A260/A280比值為1.8-1.9，RNA純度與濃度均滿(mǎn)足于下一步實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 苗期甘蔗SUT的表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)甘蔗苗期SUT的Q-PCR檢測(cè)分析，結(jié)果（圖1）顯示，不同家族的SUT在未成熟和成熟葉片中都有表達(dá)。在未成熟葉片中，與對(duì)照相比，SUT1表達(dá)量提高2.7倍，SUT4表達(dá)量提高2.9倍，SUT6表達(dá)量提高2.3倍，而在成熟葉片中，SUT1表達(dá)量降低2倍左右，SUT4表達(dá)量降低2倍左右，SUT6表達(dá)量提高3.4倍。

2.3 分蘗期SUT表達(dá)分析

圖1 苗期甘蔗中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量

通過(guò)對(duì)甘蔗分蘗期SUT的Q-PCR檢測(cè)分析（圖2）。與對(duì)照相比，SUT1在分蘗期脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中表達(dá)量分別提高7.9倍和6.0倍；SUT4在分蘗期脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中表達(dá)量分別提高5.7倍和2.3倍；SUT6在分蘗期脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中表達(dá)量分別提高4.5倍和3.6倍。

圖2 分蘗期甘蔗中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量

2.4 拔節(jié)期SUT表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)甘蔗拔節(jié)期SUT的Q-PCR檢測(cè)分析（圖3）。與對(duì)照相比，SUT1在拔節(jié)期脫毒健康種苗葉片和莖稈中的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異，其中在19-23節(jié)中降低1倍，而在莖稈中隨節(jié)間成熟度的增加其表達(dá)量有逐漸降低的趨勢(shì)，但其表達(dá)量低于對(duì)照；SUT4在拔節(jié)期脫毒健康種苗未成熟葉片中的表達(dá)量略高于對(duì)照，在莖稈中隨著莖節(jié)成熟度的增加其表達(dá)量逐漸降低，然而在1-11莖節(jié)中其表達(dá)量被上調(diào)，1-3莖節(jié)中表達(dá)量明顯高于對(duì)照，達(dá)到6.5倍；SUT6在拔節(jié)期脫毒健康種苗未成熟葉片中的表達(dá)量比對(duì)照高3.8倍，但在成熟葉片中其表達(dá)量無(wú)明顯差異，同樣隨著莖節(jié)成熟度的增加表達(dá)量逐漸降低，在1-11莖節(jié)中被上調(diào)表達(dá)，在1-3莖節(jié)中其表達(dá)量明顯高于對(duì)照，達(dá)到8.5倍，在13莖節(jié)后其表達(dá)量與對(duì)照沒(méi)有差異。

2.5 成熟期SUT的表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)甘蔗成熟期SUT的Q-PCR檢測(cè)分析（圖4）。成熟期脫毒健康種苗葉片中SUT1、SUT4和SUT6表達(dá)量高于對(duì)照，其中SUT1在未成熟葉片中相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高7.2倍，在成熟葉片中其相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高10.4倍，在1-3莖節(jié)中其相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高15.8倍，隨莖桿節(jié)間成熟度增加，其相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，在10-37莖節(jié)中無(wú)明顯差異；其中SUT4在未成熟葉片中相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高8.3倍，在成熟葉片中其相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高10.0倍，在1-3莖節(jié)中其相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高10.2倍，4-5莖節(jié)中其相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高5.2倍，在之后的莖節(jié)中表達(dá)量無(wú)明顯差異；SUT6在未成熟葉片中相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高7.1倍，在成熟葉片中其相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高10.2倍，在1-3莖節(jié)中其相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高15.4倍，4-5莖節(jié)中其相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高2.2倍，在之后的莖節(jié)中表達(dá)量無(wú)明顯差異。

圖3 拔節(jié)期甘蔗中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量

圖 4 成熟期甘蔗中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量

3 討論

甘蔗脫毒種苗比常規(guī)種苗出苗快、生長(zhǎng)快、分蘗苗多，有效莖多，蔗株高，增產(chǎn)效益明顯，同時(shí)還能夠增加蔗株的蔗糖含量，提高單位面積的經(jīng)濟(jì)效益。目前，在基因水平上將脫毒健康種苗與為未脫毒苗進(jìn)行比較的相關(guān)研究已有些報(bào)道［25，29-31］，但還沒(méi)有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SUT）方面的報(bào)道。SUT是蔗糖運(yùn)輸和積累過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其轉(zhuǎn)運(yùn)活性對(duì)蔗糖的最終積累量起著重要的作用［32-34］。SUT亞族基因在不同植物中的時(shí)空表達(dá)模式存在差異，功能也不同［35-36］。甘蔗常用栽培品種是異源多倍體且遺傳背景復(fù)雜，SUT家族基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)空表達(dá)模式不同，推測(cè)它們對(duì)甘蔗產(chǎn)量形成和糖分積累的影響也不同［34，36-37］。

已有研究表明不同類(lèi)型SUT基因在甘蔗不同蔗糖積累階段發(fā)揮不同作用［37-38］。本研究對(duì)甘蔗脫毒健康種苗中的3種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)與常規(guī)種苗相比SUT1、SUT4和SUT6均存在不同程度的上調(diào)表達(dá)，特別是在快速生長(zhǎng)代謝旺盛部位，并且在成熟期葉片和蔗糖快速積累莖節(jié)中SUTs的大幅上調(diào)表達(dá)促進(jìn)蔗糖的運(yùn)輸、分配、利用，并可能最終提高脫毒健康種苗的產(chǎn)量和糖含量。然而在甘蔗不同生長(zhǎng)時(shí)期脫毒健康種苗中SUT1、SUT4和SUT6差異表達(dá)模式不同。

在脫毒健康種苗的苗期和分蘗期葉片中3種SUT表達(dá)存在差異，并且分別在成熟葉片和未成熟葉片的表達(dá)差異也不同，SUT1和SUT4在脫毒健康種苗苗期未成熟葉片、分蘗期未成熟葉片和成熟葉片中表達(dá)高于對(duì)照；SUT6在苗期和分蘗期葉片中的表達(dá)高于對(duì)照。表明不同SUT在這兩個(gè)時(shí)期葉片蔗糖運(yùn)輸及分配中發(fā)揮不同作用，推測(cè)苗期成熟葉片中SUT1和SUT4下調(diào)表達(dá)，其葉片糖分積累減弱，有利于蔗糖運(yùn)輸，而未成熟葉片中上調(diào)表達(dá)，有利于蔗糖利用；SUT6上調(diào)表達(dá)，能夠促進(jìn)這兩個(gè)時(shí)期葉片的快速生長(zhǎng)和糖分的運(yùn)輸，推測(cè)SUT1和SUT4參與調(diào)控蔗糖積累，而SUT6可能調(diào)控蔗糖的運(yùn)輸，這在其他植物同源蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究中也得到類(lèi)似的結(jié)果［39-40］。

同時(shí)在拔節(jié)期脫毒健康種苗中SUT1的表達(dá)沒(méi)有變化，表明脫毒處理對(duì)拔節(jié)期SUT1的表達(dá)影響不大，而SUT4和SUT6在未成熟莖節(jié)中明顯上調(diào)表達(dá)。幼嫩莖節(jié)中蔗糖運(yùn)輸和代謝最活躍，蔗糖的高效運(yùn)輸有利于莖節(jié)的快速生長(zhǎng)和糖分積累，由此推測(cè)拔節(jié)期SUT4和SUT6的上調(diào)表達(dá)有利于促進(jìn)甘蔗產(chǎn)量形成及糖分積累。趙婷婷等［37］也發(fā)現(xiàn)SUT4表達(dá)量與糖分的積累呈正相關(guān)，表明SUT4對(duì)甘蔗蔗糖的快速運(yùn)輸和積累起著重要的作用。

成熟期脫毒健康種苗葉片和莖稈中不同SUT表達(dá)模式基本一致，SUT1、SUT4和SUT6在葉片和未成熟莖節(jié)中上調(diào)表達(dá)，而在成熟莖節(jié)中表達(dá)量沒(méi)有差異，表明蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠有效提高葉片中蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，促進(jìn)葉片中蔗糖的輸出和未成熟莖節(jié)中蔗糖的分配及利用，進(jìn)而促進(jìn)蔗糖的積累。莖稈的成熟主要體現(xiàn)在莖節(jié)蔗糖的含量的升高，此時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量的增加，有利于蔗糖積累，促進(jìn)莖稈的成熟，從而提高莖稈中的蔗糖含量。在水稻中通過(guò)提高蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量能夠增加其產(chǎn)量［12，41］，進(jìn)一步表明通過(guò)改變蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，能夠影響碳的分配，從而提高作物的產(chǎn)量。甘蔗脫毒健康種苗能夠有效提高甘蔗產(chǎn)量和糖分，本研究表明不同類(lèi)型蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)與其產(chǎn)量和糖分增加相關(guān)，對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因功能的更進(jìn)一步研究將有助于揭示脫毒健康種苗的增產(chǎn)增糖機(jī)理。

4 結(jié)論

在甘蔗脫毒健康種苗中，SUT1、SUT4和SUT6在不同生長(zhǎng)時(shí)期的組織中均上調(diào)表達(dá)，初步推測(cè)甘蔗進(jìn)行脫毒處理能夠上調(diào)葉片和未成熟莖節(jié)中SUT的表達(dá)，促進(jìn)蔗糖利用及積累，進(jìn)而提高蔗莖的產(chǎn)量和糖含量。