大黃素對(duì)缺氧條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的影響*

王 凱 施 思 雷少青 夏中元

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060）

血管內(nèi)皮細(xì)胞為血管腔內(nèi)的單層扁平細(xì)胞，可通過(guò)收縮和舒張調(diào)節(jié)血管內(nèi)血流量，控制血管通透性，調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境，維持正常的生理功能［1］。內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)外液體和物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)而調(diào)節(jié)血液和組織液之間的物質(zhì)交換［2］。在心血管疾病如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，缺氧可以通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)堆積和炎癥反應(yīng)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度，促進(jìn)疾病的發(fā)展［3-4］。因此減輕缺氧造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可以減輕疾病的嚴(yán)重程度。

細(xì)胞焦亡是一種炎癥反應(yīng)相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡方式，是在沙門(mén)菌感染巨噬細(xì)胞時(shí)被發(fā)現(xiàn)的［5］，可由細(xì)菌、病毒感染等一系列病理刺激激發(fā)，常伴有Caspase-1活化，以及大量炎性因子的產(chǎn)生［6］。細(xì)胞焦亡發(fā)生過(guò)程中，會(huì)在細(xì)胞膜上形成孔道，這些孔道會(huì)使細(xì)胞內(nèi)滲透壓增加，細(xì)胞吸水腫脹，最終細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外［7］。

大黃素是存在于大黃和許多其他植物中的天然的蒽醌，為中藥大黃的主要有效單體，具有抗炎癥、抗氧化作用［8-9］。目前對(duì)于大黃素在缺氧條件下對(duì)細(xì)胞焦亡的影響暫未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬在離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中建立缺氧模型，觀察大黃素對(duì)缺氧條件下細(xì)胞焦亡的影響及探討其可能存在的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料 HUVEC 購(gòu) 自 YRGene（NC006），RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清FBS為美國(guó)sciencell公司產(chǎn)品，大黃素和活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，CCK-8試劑盒為日本同仁公司產(chǎn)品，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3（NLRP3）抗體、Caspase-1抗體和 IL-1β 抗體為英國(guó)abcam公司產(chǎn)品，內(nèi)參β-actin為美國(guó)CST公司產(chǎn)品，羊抗兔熒光二抗為美國(guó)Millpore公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度為90%左右時(shí)，吸干皿內(nèi)原培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加0.25%的胰酶將貼壁細(xì)胞消化分離，輕輕吹打均勻，使細(xì)胞徹底從培養(yǎng)皿底壁脫落，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組方法 將HUVEC隨機(jī)分為4組。1）對(duì)照組：正常培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。2）缺氧12 h組：內(nèi)皮細(xì)胞置于含有5%CO2+95%N2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)過(guò)缺氧處理12 h。3）缺氧24 h組：內(nèi)皮細(xì)胞置于含有5%CO2+95%N2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)過(guò)缺氧24 h處理。4）EMO處理組：內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)先加入大黃素處理24 h后，再置于含有5%CO2+95%N2三氣培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧24 h。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 取HUVEC細(xì)胞懸液加入96孔板（每孔約1×104個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的大黃素溶液（0、20、40、60、80、100 μmol/L），持續(xù)培養(yǎng)24 h，換液后，每個(gè)孔分別加入10%的CCK-8溶液100 μL，在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm出的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。另外取對(duì)照組、缺氧12 h組、缺氧24 h組、EMO處理組細(xì)胞懸液，檢測(cè)各組吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=［A（加藥）-A（空白）］÷［A（未加藥）-A（空白）］×100%。

1.5 活性氧檢測(cè) 在6孔板中分別培養(yǎng)對(duì)照組、缺氧12 h組、缺氧24 h組、EMO處理組細(xì)胞 （處理方式如1.3中所述）。按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，收集細(xì)胞后，加入 DCFH-DA（1 mmol/L）工作液，在37℃，5%CO2的環(huán)境中避光溫育30 min，檢測(cè)各組細(xì)胞的ROS水平。

1.6 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá) 取4組培養(yǎng)的細(xì)胞，去除培養(yǎng)基后，經(jīng)PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取20 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶封閉 1 h。 分別用抗體 NLRP3 （1∶500）、Caspase-1 （1∶500）、IL-1β（1∶1000）以及內(nèi)參 β-actin（1∶1000）進(jìn)行4℃孵育過(guò)夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入熒光二抗（1∶10000），室溫孵育 1 h。洗膜 3 次，每次 10 min，使用Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀（Li-Cor公司，美國(guó)）掃描熒光蛋白條帶，用Odyssey系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，通過(guò)目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞活性比較 見(jiàn)表1，表2。當(dāng)大黃素濃度在0～60 μmol/L之間時(shí)，細(xì)胞活力逐漸增加，當(dāng)大黃素濃度為60 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力明顯升高，與0 μmol/L相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），當(dāng)大黃素濃度高于80μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降，與0μmol/L和60μmol/L相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1，故選擇60 μmol/L預(yù)處理24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如表2所示，缺氧12 h組細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而缺氧24 h組細(xì)胞活力明顯下降，與對(duì)照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)大黃素處理后，細(xì)胞活力明顯升高，與缺氧24 h組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同濃度大黃素作用下的細(xì)胞活力（±s）

表1 不同濃度大黃素作用下的細(xì)胞活力（±s）

與 0 μmol/L 比較，*P＜0.05；與 60 μmol/L 比較，△P＜0.05

?

表2 各組細(xì)胞活力比較（±s）

表2 各組細(xì)胞活力比較（±s）

與缺氧24 h組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同

細(xì)胞活力0.9 3±0.0 4缺氧 1 2 h組 6 0.8 8±0.0 8缺氧 2 4 h 組 6 0.4 4±0.0 6△E M O 處理組 6 0.7 0±0.0 5*組別 n對(duì)照組 6

2.2 各組ROS水平比較 見(jiàn)表3。缺氧12 h組ROS水平升高不明顯，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），而在缺氧24 h組中，ROS水平明顯升高，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；EMO處理組ROS水平明顯下降，與缺氧24 h組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組細(xì)胞上清ROS水平比較（±s）

表3 各組細(xì)胞上清ROS水平比較（±s）

R O S水平8 4.9 3±7.9 1缺氧 1 2 h組 6 9 4.7 3±7.3 1缺氧 2 4 h 組 6 1 2 8.3 1±1.4 2△E M O 處理組 6 1 0 1.7 1±1.9 7*組別 n對(duì)照組 6

2.3 各組焦亡蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1、表4。缺氧12 h 組 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)水平變化不明顯，與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 而在缺氧 24 h 組中 NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)蛋白水平明顯升高，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；EMO 處理組 NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯下降，與缺氧24 h組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)情況

表4 各組細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

組別 n I L-1 β N L R P 3 C a s p a s e-1對(duì)照組 6 1.0 0±0.0 0缺氧 1 2 h組 6 1.0 9±0.0 7缺氧 2 4 h 組 6 1.6 4±0.0 9△1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 1.0 6±0.0 8 1.1 3±0.0 9 2.0 9±0.1 9△ 1.7 6±0.1 1△E M O 處理組 6 1.3 2±0.0 9*1.6 8±0.0 7* 1.4 7±0.0 5*

3 討 論

缺氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損是促進(jìn)多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展的重要因素［10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外建立細(xì)胞缺氧模型，模擬在體血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血缺氧環(huán)境，有利于排除其他在體因素的干擾，可以較為準(zhǔn)確地研究缺氧單一因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。在缺氧條件下，可以通過(guò)多種途徑使內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生增多［11-12］。ROS是細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，ROS可通過(guò)半胱天冬氨酸蛋白酶、溶酶體蛋白酶或是內(nèi)切核酸酶引起3種類型的程序性細(xì)胞死亡，分別是細(xì)胞凋亡、自噬和細(xì)胞焦亡［13］。細(xì)胞焦亡作為一種程序性的細(xì)胞死亡方式，主要通過(guò)激活NOD樣受體（NLRs），尤其是NLRP3炎性小體而發(fā)揮作用。在細(xì)胞缺氧后，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS激活NLRP3炎性小體，激活的NLRP3炎性小體一方面可以激活I(lǐng)L-1β，進(jìn)而引起細(xì)胞焦亡加重細(xì)胞損傷。

大黃素作為蒽醌衍生物可以使胞漿中Ca2+濃度降低和 ROS 的產(chǎn)生［14］，減少 Caspase-1 和 IL-1β 的活化，減輕細(xì)胞焦亡，減輕細(xì)胞損傷。目前有學(xué)者認(rèn)為，Caspase-1的激活是IL-1β活化以及焦亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟，但是Caspase-1是如何激活I(lǐng)L-1β和焦亡，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，與正常氧濃度培養(yǎng)的細(xì)胞相比，細(xì)胞在缺氧條件下，ROS產(chǎn)生增加，進(jìn)而激活Caspase-1前體蛋白，活化的Caspase-1剪切加工IL-1β，進(jìn)而使IL-1β活化，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡增加。缺氧細(xì)胞進(jìn)過(guò)大黃素處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降，Caspase-1和IL-1β活化減少，細(xì)胞焦亡減少，損傷減輕。

綜上所述，本研究結(jié)果表明缺氧誘導(dǎo)焦亡發(fā)生，而大黃素可以通過(guò)抑制缺氧細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，抑制NLRP3炎性小體和Caspase-1活化，減少焦亡發(fā)生。本研究結(jié)果提示，大黃素對(duì)缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，可以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)心血管疾病的防治作用。