土壤生態(tài)系統(tǒng)硝化微生物研究進(jìn)展

楊 賽,朱 琳,魏 巍*

(1.江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

1 經(jīng)典自養(yǎng)硝化(兩步自養(yǎng)硝化)微生物

1.1 經(jīng)典自養(yǎng)硝化(兩步自養(yǎng)硝化)作用概念

經(jīng)典自養(yǎng)硝化(兩步自養(yǎng)硝化)作用是指自養(yǎng)微生物利用CO2為主要或者唯一碳源進(jìn)行的硝化作用。經(jīng)典自養(yǎng)硝化作用過程中，微生物先將氨氧化為亞硝酸鹽,然后亞硝酸鹽再被氧化為硝酸鹽，分兩步完成[13]。土壤生態(tài)系統(tǒng)中常見的進(jìn)行經(jīng)典自養(yǎng)硝化的微生物如表1所示，主要分布在古細(xì)菌的奇古菌門以及細(xì)菌的硝化螺旋菌門和變形菌門。

表1 土壤生態(tài)系統(tǒng)中常見的經(jīng)典自養(yǎng)硝化微生物

注：表中未填寫部分代表該種微生物還未進(jìn)行分類;加☆的是不可純培養(yǎng)的微生物。

1.2 經(jīng)典自養(yǎng)硝化(兩步自養(yǎng)硝化)微生物酶及其編碼基因

經(jīng)典自養(yǎng)硝化(兩步自養(yǎng)硝化)作用包括氨氧化和亞硝酸氧化兩個(gè)階段[12]。作為該作用的限速步驟，氨氧化階段主要分為兩個(gè)過程，氨先被氧化為羥胺(NH2OH)，然后羥胺被氧化為亞硝酸，調(diào)控兩個(gè)過程的關(guān)鍵酶分別為氨單加氧酶(ammonia monooxygenase,Amo)和羥胺氧化還原酶(hydroxylamine oxidase,Hao)[14]。Amo是一個(gè)三聚體膜結(jié)合蛋白[14]，該蛋白是由分別被amoA、amoB、amoC所編碼的α、β、γ 3個(gè)亞基所組成，其中amoA基因是編碼氨單加氧酶多肽活性位點(diǎn)的基因[15]；Hao是一種結(jié)構(gòu)排列復(fù)雜由3個(gè)亞基組成蛋白，每個(gè)亞單位由8個(gè)共價(jià)結(jié)合的血紅素組成，其中有7個(gè)C型血紅素和1個(gè)P460血紅素，P460被認(rèn)為是該酶的活性中心[15]。亞硝酸氧化階段是由亞硝酸鹽氧化還原酶(nitrite oxidoreductase,Nxr)催化完成的單步過程[16]。Nxr為多亞基的膜聯(lián)復(fù)合體，基本結(jié)構(gòu)為可以催化硝酸鹽和亞硝酸鹽相互轉(zhuǎn)化的α亞基以及具有電子傳遞功能的β亞基和γ亞基，除以上3個(gè)常見亞基外，一些微生物，如Nitrobacterhamburgensis的Nxr包含雙血紅素C亞基，但該亞基的作用尚未可知[16]。該3種經(jīng)典自養(yǎng)硝化過程中關(guān)鍵酶的編碼基因中，amoA作為靶功能基因序列廣泛地應(yīng)用于該自養(yǎng)硝化作用過程中AOA和AOB類群的分子生態(tài)學(xué)研究中。

1.3 經(jīng)典自養(yǎng)硝化(兩步自養(yǎng)硝化)微生物生態(tài)多樣性

經(jīng)典自養(yǎng)硝化(兩步自養(yǎng)硝化)微生物廣泛分布于陸地土壤、沉積物、水體等生態(tài)環(huán)境中[29]。按照自養(yǎng)硝化的步驟，其可分為以下兩類：1．氨氧化菌包括氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)。在第九版伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)中，AOB被分為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)[30]；AOA是獨(dú)立于AOB進(jìn)化支之外的類群，到目前為止可培養(yǎng)的AOA僅有NitrososphaeraviennensisEN76[18]和NitrosopumilusmaritimusSCM1[6]兩株，不可純培養(yǎng)的富集物卻有不少[19-23]。羅劍飛等[29]認(rèn)為，目前所有已知的AOA都屬于奇古菌門(Thaumarchaeota)，自此將NitrosopumilusmaritimusSCM1、Cenarchaeumsymbiosum和CandidatusNitrosoarchaeumlimnia等納入Group Ⅰ.1a(海洋組)，將NitrososphaeraviennensisEN76和CandidatusNitrososphaeragargensis等納入Group Ⅰ.1b(土組)，將CandidatusNitrosocaldusyellowstonii等納入Group Ⅲ，由于CandidatusNitrosotaleadevanaterra的16S rRNA基因和amoA基因序列與Group Ⅰ.1a的同源性大于Group Ⅰ.1b，但與已知的Group Ⅰ.1a的序列比較又形成獨(dú)立的分支，因此其被納入Group Ⅰ.1a-associated。2．亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB)包括硝化刺菌屬(Nitrospina)、硝化球菌屬(Nitrococcus)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、硝化螺菌屬(Nitrospira)[31]。其中，氨氧化菌(AOA和AOB)更多作為自養(yǎng)硝化作用的指示菌株進(jìn)行各種土壤生態(tài)系統(tǒng)中相關(guān)生態(tài)學(xué)特征研究。

高利海等[32]對(duì)養(yǎng)蝦池底泥中的氨氧化菌群落多樣性進(jìn)行研究，構(gòu)建了AOA和AOB的amoA基因克隆文庫，利用末端限制性酶切技術(shù)將克隆文庫中的陽性克隆子歸類分成若干個(gè)可操作分類單元(Operational Taxa Units,OTUs)，分析后發(fā)現(xiàn)AOB的amoA基因克隆文庫(包括13個(gè)OUTs)中的序列屬于變形桿菌門β亞綱(β-Proteobacteria)中的亞硝化單細(xì)胞菌屬(Nitrosomonas)及Nitrosomonas-like,AOA的amoA基因克隆文庫(包括9個(gè)OUTs)中的序列幾乎都屬于泉古菌門(Crenarchaeote)，AOA的群落結(jié)構(gòu)單一且存在一個(gè)優(yōu)勢(shì)類群OUT3(克隆子數(shù)目占克隆文庫的57.45%)，由此發(fā)現(xiàn)在該環(huán)境中氨氧化細(xì)菌多樣性大于氨氧化古菌。袁飛等[33]以我國(guó)3種不同地區(qū)的土壤為研究對(duì)象，使用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)土壤氨氧化菌區(qū)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)紅壤包括4個(gè)氨氧化菌種屬，潮土包括5個(gè)氨氧化菌種屬，黃泥土包括4個(gè)氨氧化菌種屬，分析發(fā)現(xiàn)3種土壤的氨氧化菌群存在顯著差異，紅壤與潮土、黃泥土的氨氧化菌種群差異較為明顯，認(rèn)為這種差異可能與pH值有關(guān)。

由此可見，經(jīng)典硝化微生物具有多樣的種類和生態(tài)分布，它們大多都存在于土壤生態(tài)系統(tǒng)中，因此利用傳統(tǒng)和非傳統(tǒng)手段來研究土壤生態(tài)系統(tǒng)就顯得十分重要。

2 全程氨氧化(單步自養(yǎng)硝化)微生物

2.1 全程氨氧化(單步自養(yǎng)硝化)作用概念

表2 已描述的全程氨氧化微生物

注：表中未填寫部分代表該種微生物還未進(jìn)行分類；加※的是未經(jīng)過純培養(yǎng)的微生物。

2.2 全程氨氧化(單步自養(yǎng)硝化)微生物酶及其編碼基因

上述的3個(gè)科研團(tuán)隊(duì)在發(fā)現(xiàn)了全程氨氧化微生物的同時(shí)，也對(duì)其關(guān)鍵的酶和相關(guān)編碼基因進(jìn)行了解析。Pinto等[12]研究發(fā)現(xiàn)Nitrospira-Like Bacteria含有氨氧化所需的全部基因包括amoA、amoB、amoC、hao，但進(jìn)行宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其amoA基因與編碼典型氨氧化菌(AOB和AOA)的氨單加氧酶(Amo)的amoA基因不同，也不同于編碼甲烷氧化細(xì)菌的甲烷單加氧酶基因，但與最近發(fā)現(xiàn)的編碼全程氨氧化微生物的氨單加氧酶基因卻處于同一簇之中。

Kessel等[10]研究發(fā)現(xiàn)CandidatusNitrospiranitrosa和CandidatusNitrospiranitrificans的基因組中含有編碼氨單加氧酶(Amo)和羥胺氧化還原酶(Hao)的全套基因以及編碼亞硝酸氧化還原酶(Nxr)亞基的基因。與已報(bào)道的經(jīng)典硝化作用的微生物有所不同的是，Ca.N.nitrosa含有3個(gè)不連續(xù)的amoC編碼基因，其中一個(gè)amoC基因與另一個(gè)amoC基因有97.7%氨基酸同一性；Ca.N.nitrificans缺少第二個(gè)amoA基因，包含了4個(gè)額外的amoC基因和一個(gè)第二haoA基因；Ca.N.nitrosa有兩個(gè)nxrAB基因可以編碼同一個(gè)NxrB亞基，但是NxrA亞基的氨基酸有89.6%相似；Ca.N.nitrificans有4個(gè)幾乎一樣(氨基酸相似性>99%)的Nxr的α和β亞基[10]。

而對(duì)于CandidatusNitrospirainopinata，Daims等[11]研究結(jié)果則表明其擁有亞硝酸鹽氧化作用的關(guān)鍵酶-亞硝酸鹽氧化還原酶(Nxr)，其基因組包含nxrA和nxrB基因以及4個(gè)nxrC基因分別編碼Nxr的α、β、γ 3個(gè)亞基，它也擁有氨氧化標(biāo)志性酶(Amo、Hao)的同系物，其amoA基因與典型的Amo的基因不同，Amo的3個(gè)亞基α、β和γ由一個(gè)amoCAB基因簇和另外兩個(gè)在其他基因位點(diǎn)的amoC基因編碼。由此可見，全程氨氧化微生物均含有與經(jīng)典自養(yǎng)硝化微生物相同功能的氨單加氧酶(Amo)和羥胺氧化還原酶(Hao)，但是編碼這些功能酶的基因種類和序列均不相同。這些編碼基因的差異，尤其是amoA基因的不同，也許可以為全程氨氧化微生物設(shè)計(jì)出其特異性的分子生態(tài)學(xué)檢測(cè)工具。

2.3 自養(yǎng)硝化微生物(單步硝化)生態(tài)多樣性

到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的4種全程氨氧化微生物存在于多種生態(tài)系統(tǒng)中[10-12]。Kessel等[10]研究發(fā)現(xiàn)在土壤生態(tài)環(huán)境如農(nóng)田土壤、森林土壤，水域生態(tài)系統(tǒng)如濕地、稻田水域、淡水、湖泊以及活性污泥和飲用水處理系統(tǒng)等都有全程氨氧化微生物的存在。Gruber-Dorninger C等[36]對(duì)丹麥西奧爾堡和維也納的污水處理廠的污泥進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)占全部檢測(cè)到的細(xì)菌(7.5±3)%的硝化螺菌屬，比占(2.5±1.2)%的氨氧化細(xì)菌有優(yōu)勢(shì)，且并未在基因數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)有屬于奇古菌的序列。Lapara等[37]研究了美國(guó)明尼蘇達(dá)州St.Paul水廠的活性炭過濾池發(fā)現(xiàn),占13%～21%的硝化螺菌屬種群豐度最高，AOB的amoA基因豐度小于0.07%，AOA的amoA基因并沒有發(fā)現(xiàn)。以上例子說明了在這些環(huán)境中可能存在有全程氨氧化微生物。董興水等[34]甚至認(rèn)為全程氨氧化微生物廣泛分布于除海洋以外的其它環(huán)境中。

由此可見，進(jìn)行單步硝化作用的全程氨氧化微生物豐富了硝化微生物的種類及其生態(tài)分布，這進(jìn)一步啟發(fā)了人們對(duì)土壤中全程氨氧化微生物菌種資源的挖掘。

3 異養(yǎng)硝化微生物

3.1 異養(yǎng)硝化作用概念

異養(yǎng)硝化作用與自養(yǎng)硝化作用有一定不同，兩者不僅對(duì)能源和氮源的利用不同，還在底物的利用類型上有所不同，異養(yǎng)硝化作用的底物可以是無機(jī)氮也可以是有機(jī)氮，自養(yǎng)硝化作用的底物只能是無機(jī)氮。更有研究發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)硝化作用過程中有機(jī)氮直接被氧化為硝酸鹽氮，而跨過了有機(jī)氮分解為氨氮、再養(yǎng)化為亞硝酸鹽氮的過程[38-42]。因此，異養(yǎng)硝化作用是異養(yǎng)微生物在好氧條件下將氨/銨或氧化態(tài)-3的有機(jī)態(tài)N氧化為羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程[5]。生態(tài)系統(tǒng)中常見的進(jìn)行異養(yǎng)硝化的微生物如表3所示。不僅包括細(xì)菌的變形菌門、擬桿菌門和放線菌門的部分類群，還包括了子囊菌門和擔(dān)子菌門的部分真菌類群。

3.2 異養(yǎng)硝化微生物酶

在異養(yǎng)硝化微生物進(jìn)行異養(yǎng)硝化作用中已知的可能發(fā)揮作用的酶有以下幾種：1．氨單加氧酶(Amo)，該酶在Paracoccusdenitrificans和Pseudomonasputida等異養(yǎng)細(xì)菌中都已經(jīng)被純化分離出來，分析分離純化的酶發(fā)現(xiàn)其由兩個(gè)亞基組成，其分子量與自養(yǎng)菌的氨單加氧酶的兩個(gè)亞基amoA和amoB類似[50]；但其與自養(yǎng)硝化作用中的Amo又有一定不同，如：1 mmol/L的乙炔并不能抑制該酶的活性[51]。2．羥胺氧化酶(Hao)，又稱羥胺-細(xì)胞色素C還原酶(Hydroxylamine cytochrome creductase)，已經(jīng)在Pseudomonas屬和Arthrobacter屬等[52-53]菌種中純化分離出來，從現(xiàn)有研究結(jié)果來看，與自養(yǎng)硝化細(xì)菌的羥胺氧化酶存在明顯或部分不同的特點(diǎn),如異養(yǎng)硝化細(xì)菌的Hao結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,只是一個(gè)單體蛋白，并且不含血紅素[51]。3．丙酮酸肟加雙氧酶(Pyruvic oxime dioxyg-enase,Pod)，Ono等[54-55]在糞產(chǎn)堿桿菌中分離純化出了Pod，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該酶為115 kDa，含3個(gè)相同分子量的亞基(40 kDa)，每個(gè)亞基中含有一個(gè)Fe原子，維生素C的加入可以明顯加強(qiáng)酶活性，該酶反應(yīng)的最適pH值為7.5[56]。盡管人們對(duì)異養(yǎng)硝化微生物的關(guān)鍵酶和編碼基因已有所認(rèn)知，但是目前還沒有可以進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)特異性檢測(cè)的引物等工具，因此目前異養(yǎng)硝化微生物的研究還僅局限于單菌的分離和生理生化特征的檢測(cè)。

表3 生態(tài)系統(tǒng)中常見異養(yǎng)硝化微生物

3.3 異養(yǎng)硝化微生物生態(tài)多樣性

異養(yǎng)硝化微生物多存在于土壤、污泥、水體等環(huán)境中，土壤中的異養(yǎng)硝化微生物包括放線菌、真菌、細(xì)菌等[57]。其中真菌是異養(yǎng)硝化菌中數(shù)量最多、效率最高的[42]。同時(shí)具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的這些異養(yǎng)硝化微生物，對(duì)于環(huán)境中氮的去除具有很好的應(yīng)用前景[58]，因此對(duì)于異養(yǎng)硝化微生物研究的報(bào)道較多?？讖?qiáng)等[59]在天津北運(yùn)河沉積物中分離純化出了3株異養(yǎng)硝化菌，其中兩株HN5和HN6為真菌，另一株NH4為細(xì)菌，經(jīng)過16S rDNA序列和真菌ITS序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，初步認(rèn)為NH5和NH6為同一菌株Candidapalmioleophila，NH4為Shigella。張光亞等[39]從大棚土壤中分離純化出了一株異養(yǎng)型硝化細(xì)菌，命名為HN。

蘇俊鋒等[60]篩選出6株異養(yǎng)硝化細(xì)菌，將該6株菌運(yùn)用到污水處理系統(tǒng)中，并采用PCR-DGGE方法對(duì)SBR(序批式活性污泥法)反應(yīng)器中不同時(shí)期(第1 d、第15 d和第30 d)的群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，圖譜結(jié)果表明微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)演替，在第1 d時(shí)群落結(jié)構(gòu)變化不明顯，在第15 d時(shí)群落演替較快，在第30 d時(shí)具有最高的種群多樣性且形成了穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)。

由此可見，異養(yǎng)硝化微生物具有多樣的種類和生境，其代謝途徑也并不單一，催化其反應(yīng)的酶也多種多樣，運(yùn)用多種技術(shù)對(duì)其進(jìn)行研究就顯得尤為關(guān)鍵。

4 硝化微生物生態(tài)研究方法

4.1 硝化微生物的群落多樣性檢測(cè)方法

(1)末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(Terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)是建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)基礎(chǔ)之上發(fā)展起來的一種微生物群落分析技術(shù)，該技術(shù)具有分辨率高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)共享等優(yōu)勢(shì)，通過對(duì)環(huán)境樣品總DNA提取，經(jīng)過16S rDNA的PCR擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，由生物技術(shù)公司進(jìn)行分析得到T-RFLP圖譜，根據(jù)圖譜分析計(jì)算多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)[61]。林煒鐵等[62]利用該技術(shù)，對(duì)富集反應(yīng)器內(nèi)硝化微生物群落的種群結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行解析，分別培養(yǎng)12、24、48 h后，根據(jù)OTU數(shù)量，對(duì)硝化細(xì)菌樣品中的多樣性指數(shù)以及均勻度指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果為：在分別培養(yǎng)12、24、48 h后多樣性指數(shù)分別為1.39、1.21、0.45，在分別培養(yǎng)12、24、48 h后均勻度指數(shù)分別為0.58、0.62、0.64。

(2)變性梯度凝膠電泳技術(shù)(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是可以檢測(cè)DNA點(diǎn)變異的一種方法，其原理是在聚丙烯酰胺凝膠(含有梯度變性劑)電泳過程中,可將長(zhǎng)度相同的雙鏈DNA因其堿基排列順序不同而分離[63]，該技術(shù)在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面有一定作用?；谠摷夹g(shù)，Kowalchuk等[64]研究堆積土中Proteobacteria門β亞綱中氨氧化菌的種群多樣性，研究表明β亞綱中的Nitrosospira是廣泛分布于自然界中的一類氨氧化菌，這類菌群可以由于土壤酸堿性的不同而出現(xiàn)明顯的差異。郭佳等[65]研究了三峽消落帶土壤培養(yǎng)的第0、13 d樣品。得到了亮度不等、數(shù)量不同且位置各異的電泳條帶，表明不同消落帶不同淹水-落干次數(shù)條件下的硝化微生物群落組成具有一定差異。

(3)基因序列文庫技術(shù)能夠提供更多物種間和混合種群中基因變化的特定信息。將環(huán)境樣品的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆全部基因片段并測(cè)序,建立基因序列文庫，從中隨機(jī)選擇克隆子進(jìn)行測(cè)序和排列，通過對(duì)大量克隆子詳細(xì)序列信息的采集,能夠評(píng)估每個(gè)變異基因的相對(duì)比例,測(cè)定總基因多樣性和特定種群組成[66]。陳哲等[67]研究化肥對(duì)土壤硝化功能菌組成的影響，通過構(gòu)建16S rDNA細(xì)菌的氨單加氧酶基因(amoA)文庫發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期單施肥導(dǎo)致細(xì)菌16S rDNA和amoA的多樣性明顯低于CK和NPK處理。

(4)高通量測(cè)序技術(shù)是因傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序技術(shù)局限性日益突出，從而發(fā)展起來的一種測(cè)序方法，該技術(shù)可對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA分子進(jìn)行同時(shí)測(cè)序，目前該技術(shù)包括以454技術(shù)(Roche公司)、Solexa技術(shù)(Illumina公司)以及Solid技術(shù)(ABI公司)為代表組成的第二代測(cè)序技術(shù)，還包括以HeliScope TIRM和Pacific Biosciences SMRT為代表的單分子測(cè)序技術(shù)，可進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序、價(jià)格低廉以及具有定量功能是高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)[68]。梁滬蓮等[69]基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4種硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)物(以銨鹽為氮源的淡水富集物A、以亞硝酸鹽為氮源的淡水富集物B、以銨鹽為氮源的低溫淡水富集物C和以亞硝酸鹽為氮源的海水富集物D)的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)樣品共檢測(cè)到24門47綱129屬，4個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門；樣品 A、B、C的優(yōu)勢(shì)菌綱為β-變形菌綱和γ-變形菌綱，樣品D的優(yōu)勢(shì)菌綱為γ-變形菌綱、δ-變形菌綱和芽孢桿菌綱；而優(yōu)勢(shì)菌屬各不相同，其中樣品A為亞硝化單胞菌屬(24.56%)，樣品B為鏈霉菌屬(7.15%)，樣品C為噬菌弧菌屬(19.36%)和類諾卡氏菌屬(19.35%)，樣品D為嗜酸菌屬(13.6%)和柄桿菌屬(11.5%)。共檢測(cè)出7種具有硝化功能的細(xì)菌，其中樣品A、B和D中主要是亞硝化單胞菌屬，占比分別為24.56%、4.94%和0.63%，樣品C主要為Nitrospirillum(0.69%)和硝化螺旋菌屬(0.69%)。

4.2 硝化微生物的群落豐度檢測(cè)方法

(1)熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization,FISH)的原理是核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)。用標(biāo)記的DNA或者RNA探針與單鏈核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，用熒光基團(tuán)對(duì)探針進(jìn)行直接標(biāo)記并與目標(biāo)序列結(jié)合，最后利用熒光顯微鏡直接觀察[70]。FISH技術(shù)檢測(cè)環(huán)境樣品中硝化細(xì)菌與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以提供環(huán)境微生物數(shù)量和空間分布等多種信息[71]。朱琳等[71]用該方法對(duì)江蘇太湖、南京玄武湖、南京鎖金村污水處理廠活性污泥中硝化細(xì)菌分布進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，環(huán)境樣本中亞硝化細(xì)菌和硝酸菌含量分別是：太湖1.68×103、0.54×103cells/mL；玄武湖1.34×103、0.38×103cells/mL；鎖金村污水處理廠活性污泥8.30×106、0.52×106cells/g。

(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time fluorscent quantitative PCR)具有可定量、特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快等特點(diǎn)，是一種檢測(cè)目的核酸拷貝數(shù)的可靠方法，利用該技術(shù)研究硝化微生物時(shí)，能夠?qū)Σ煌惾旱陌毖趸M(jìn)行定量，從而達(dá)到對(duì)其在環(huán)境中的檢測(cè)，該方法是目前公認(rèn)最準(zhǔn)確的定量研究微生物種群的方法[72]。應(yīng)用該技術(shù)，吳沿友等[73]解析了硝化細(xì)菌在泉州灣濕地中不同區(qū)域和不同植被土壤中的數(shù)量變化規(guī)律，結(jié)果表明，不同區(qū)域和不同植被土壤中硝化桿菌屬、硝化螺菌屬、亞硝化單胞菌屬硝化細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量有顯著差異，有植被的土壤高于空地和裸地。

5 展望

硝化微生物存在于各種土壤生態(tài)系統(tǒng)中，它與土壤生態(tài)系統(tǒng)中的氮素循環(huán)密切相關(guān)，同時(shí)也涉及到一定的生態(tài)環(huán)境問題。因此，運(yùn)用多種研究手段，研究不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中硝化微生物的種類和多樣性就顯得十分重要，具有一定的生態(tài)學(xué)意義。隨著科學(xué)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)、原位分離技術(shù)、質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)等多重技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用將為探索硝化微生物的生態(tài)學(xué)作用提供有力的支持?；谶@些多重的分析技術(shù)，研究者們有望解決硝化微生物研究中的諸多熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題，例如：

(1)氨氧化古菌的發(fā)現(xiàn)引起了學(xué)界對(duì)于其機(jī)理、種類等方面研究的熱潮，近年來我國(guó)學(xué)者賀紀(jì)正等對(duì)于氨氧化古菌方面的研究具有較大突出貢獻(xiàn)。鑒于AOA產(chǎn)生N2O的機(jī)理以及催化該過程的酶的不確定，以及AOA難以純化培養(yǎng)等問題，未來利用基于高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)手段，在土壤原位條件下研究氨氧化古菌的時(shí)空演變等生態(tài)特征，評(píng)估它們?cè)谙趸饔煤彤a(chǎn)生溫室氣體N2O的相對(duì)貢獻(xiàn)等問題，都將是未來的研究熱點(diǎn)。

(2)單步硝化作用的發(fā)現(xiàn)使得人們對(duì)硝化作用的過程有了新的認(rèn)識(shí)，單步硝化作用將是未來一段時(shí)間內(nèi)學(xué)界對(duì)于硝化作用研究的一大熱點(diǎn)。但是由于其研究起步較晚，所以有很多亟待解決的問題如：全程氨氧化微生物的代謝機(jī)理過程是如何進(jìn)行的；全程氨氧化作用的影響因子有哪些；能否開發(fā)全程氨氧化微生物的特異性研究方法；全程氨氧化微生物在土壤，尤其是農(nóng)田土壤氮素轉(zhuǎn)化過程中是否發(fā)揮著一定的作用等一系列問題均可能成為接下來的研究熱點(diǎn)。

(3)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌由于具有同時(shí)硝化反硝化(SND)的特性，使得其對(duì)土壤和水體中多余氮素的除去具有一定作用，這將是今后的研究熱點(diǎn)之一。但是其代謝過程尚未形成統(tǒng)一的定論，不同的菌株表達(dá)的酶系不同，代謝途徑也有所不同。為了更好的指導(dǎo)與異養(yǎng)硝化有關(guān)的生物脫氮技術(shù)，需要解析不同的異養(yǎng)硝化微生物硝化機(jī)理和不同的異養(yǎng)硝化微生物的酶及其功能基因作用機(jī)理等問題，如此才能將異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌高效合理的應(yīng)用于實(shí)際。