鮮蒜貯藏期主要病原菌分離鑒定及臭氧抑菌效果研究

蘭 璞，紀(jì)海鵬，賈 凝，張 娜，于晉澤，董成虎,3,*

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所（國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工

程技術(shù)研究中心（天津）），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；3.天津市興有果蔬種植專(zhuān)業(yè)合作社，天津 301714）

大蒜（AlliumsativumL.）也稱(chēng)為蒜頭、大蒜頭、胡蒜，是蒜類(lèi)植物的統(tǒng)稱(chēng)[1]，為半年生草本植物，屬百合科蔥屬，以鱗莖入藥。從古至今埃及、中國(guó)、日本等一直用大蒜治療多種疾病。大蒜是秦漢時(shí)從西域傳入我國(guó)，經(jīng)人工栽培繁育，具有抗癌功效，深受大眾喜食[2]。大蒜呈扁球形或短圓錐形，外層是灰白色或淡棕色膜質(zhì)鱗皮，剝?nèi)[葉，內(nèi)有6～10個(gè)蒜瓣，輪生于花莖的周?chē)o基部盤(pán)狀，生有多數(shù)須根，有濃烈的蒜臭，味辛辣，有刺激性氣味，可食用或供調(diào)味。目前我國(guó)大蒜主要栽培品種有：山東蒼山大蒜品種群、吉林白馬芽、山東金鄉(xiāng)白蒜、江蘇太倉(cāng)白蒜、陜西蔡家坡紫皮蒜、黑龍江阿城大蒜、天津?qū)氎娲笏獾取１狙芯克x試材為天津?qū)氎娲笏?，?瓣為主，蒜瓣在莖盤(pán)上圍成一輪，蒜皮為紫紅色，蒜瓣潔白、均勻，鮮嫩多汁，口感辛辣，脆香濃郁，肉質(zhì)肥厚[3]。大蒜傳統(tǒng)的貯藏方法有掛藏法、堆藏法、埋藏法、輻射貯藏和化學(xué)藥劑處理貯藏[4]。目前市場(chǎng)上流通的大蒜主要是干蒜，源于其耐貯性。事實(shí)上新鮮大蒜口感更為鮮美，適于鮮食，但不易保存，在貯運(yùn)過(guò)程中易受微生物污染，導(dǎo)致蒜瓣失水干縮、腐敗發(fā)芽、易霉化軟爛等問(wèn)題發(fā)生，使鮮蒜的品質(zhì)和商品價(jià)值受到影響。

目前果蔬的貯藏保鮮方法主要有低溫、臭氧、1-甲基環(huán)丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）、涂膜、煙霧劑保鮮等。曹琳等[5]研究表明：臭氧處理大蒜可有效抑制赤霉、橘青霉等的生長(zhǎng)發(fā)育，改變菌體形態(tài)。張靜林等[6]采用30 mg/m3臭氧對(duì)脫水蒜片進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)蒜片中菌落總數(shù)得到顯著抑制，且不影響蒜片內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分。姜楠等[7]發(fā)現(xiàn)采用臭氧處理后的交鏈孢菌對(duì)生物活性的不良影響顯著降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)適宜濃度的臭氧處理能夠降解交鏈孢菌的多種芽孢菌，使得毒力得以顯著降低。臭氧由于具有強(qiáng)氧化性且使用后無(wú)殘留，被廣泛應(yīng)用于食品加工車(chē)間食品表面殺菌、防腐保鮮等多個(gè)領(lǐng)域[8]。臭氧處理果蔬，既有可靠的殺菌保鮮效果，又沒(méi)有任何有害殘留[9-10]。冷藏或氣調(diào)貯藏配合臭氧處理是一項(xiàng)新型的果蔬保鮮方式[11]。根據(jù)臭氧在果蔬貯藏的研究報(bào)道，明確得到的結(jié)論是隨貯藏庫(kù)溫度升高或相對(duì)濕度增加，臭氧的分解速率明顯加快[12]。每年的冬季市面上大多為干蒜，鮮有可口的鮮蒜，因此本研究主要以貯藏5個(gè)月的寶坻鮮蒜為試材，進(jìn)一步探索驗(yàn)證貯藏后期鮮蒜的主要致病微生物和致病微生物控制方法，以期獲得新鮮的大蒜病害控制技術(shù)，滿足廣大消費(fèi)者對(duì)鮮蒜食用需求。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

材料：貯藏后期的寶坻鮮蒜，于2019年5月購(gòu)買(mǎi)，鮮蒜購(gòu)買(mǎi)時(shí)含水量為64～66 g/100 g。挑選整理后用長(zhǎng)1 m、寬0.6 m、厚度0.05 mm的鮮蒜專(zhuān)用PE袋包裝，每袋15 kg置于冷庫(kù)的架子上，貯藏溫度（0±0.5）℃，相對(duì)濕度（RH）90%～95%，至2019年12月之后開(kāi)始出現(xiàn)輕微發(fā)霉現(xiàn)象，挑選表面已霉變或產(chǎn)生霉變趨勢(shì)，甚至生長(zhǎng)出病原菌的鮮蒜進(jìn)行致病微生物的分離鑒定，對(duì)分離的菌株進(jìn)行鮮蒜反接種及分離純化，并采用臭氧處理進(jìn)行鮮蒜主要致病菌的抑制試驗(yàn)。

瓊脂粉，北京奧博星生物化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品；葡萄糖，天津市科威有限公司產(chǎn)品；土豆，購(gòu)于天津市西青區(qū)物美超市。

1.1.2 儀器與設(shè)備

VS-1300-V型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B智能生化培養(yǎng)箱，上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；氣調(diào)冷庫(kù)，意大利Isolcell公司；557115游標(biāo)卡尺，艾威博爾研發(fā)制造有限公司；BX51TF攝像顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）培養(yǎng)大蒜的病害組織，即去皮馬鈴薯200 g，瓊脂15～20 g，葡萄糖20 g，超純水1 000 mL。

1.2.2 大蒜病原真菌的分離流程

冷藏條件下獲取發(fā)病大蒜→無(wú)菌環(huán)境下分離大蒜病害組織→PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)病害組織→鏡檢→培養(yǎng)基上多次純化→獲得單菌落菌株→鏡檢→確定病原菌[13-14]

1.2.3 大蒜病原真菌菌落形態(tài)觀察及分離鑒定

觀察分離培養(yǎng)基平板上菌落的形態(tài)，包括形狀、色澤、大小、菌絲特征[15-16]；將單菌落的病原菌制片后無(wú)需染色直接在4倍、10倍、20倍和40倍目鏡下觀察菌絲形態(tài)和孢子形狀，記錄觀察結(jié)果并拍照[17]；分離純化后的菌種經(jīng)過(guò)反接種試驗(yàn)來(lái)確定其致病性，如果發(fā)病癥狀與貯藏中的腐爛癥狀相同[18-19]，作為采后病害病原菌進(jìn)一步鑒定到屬種，分離鑒定方法參照《真菌鑒定手冊(cè)》等書(shū)籍[20-23]。

1.2.4 主要病原菌回接與臭氧處理

在無(wú)菌環(huán)境下切分發(fā)病鮮蒜病斑與健康組織交界處（1 cm×1 cm）后置于PDA培養(yǎng)基上，隨后放入培養(yǎng)箱中，設(shè)定培養(yǎng)箱環(huán)境為25℃。在已培養(yǎng)好的平板上打孔取菌餅，將菌餅置于新培養(yǎng)基中央繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)3次后得到純化病原菌，采用菌液法[22]制備孢子懸浮液。

將主要病原菌侵染回接至已消毒的健康鮮蒜上，采用刺傷接種法[14]，使用無(wú)菌針在鮮蒜赤道部位制造傷口（大小約為4 mm×4 mm），將10μL孢子液注入傷口，被接種的鮮蒜貯藏在不同溫度（0、25℃）條件下通過(guò)不同濃度（17.152、21.44 mg/m3）的臭氧氣體熏蒸處理，每天進(jìn)行不同時(shí)間（12、18 h）臭氧處理，共貯藏7 d。

每天隨機(jī)取樣，采用“十字交叉法”測(cè)量鮮蒜表面菌落的直徑，每次取各處理組10個(gè)鮮蒜進(jìn)行測(cè)定，每次測(cè)定重復(fù)3次。選擇25℃旨在模擬室溫貨架溫度，同時(shí)將不同溫度下不作其他處理的接種大蒜作為空白對(duì)照組（CK）[24-25]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)與作圖，使用SPSS 20.0軟件用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮蒜病原菌菌落細(xì)胞形態(tài)特征觀察及鑒定

在本試驗(yàn)的冷藏條件下貯藏半年后，鮮蒜表面出現(xiàn)病斑。分離出鮮蒜的病變組織，并用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察后，通過(guò)劃線法分離，經(jīng)過(guò)多次純化后，得出單菌落菌株，分別鏡檢，確定鮮蒜的病原菌。

如圖1A所示，分生孢子呈紡錘狀或倒棒狀，頂端延長(zhǎng)成喙?fàn)?，多?xì)胞，有壁磚狀分隔，分生孢子常數(shù)個(gè)成鏈。根據(jù)菌落細(xì)胞的形態(tài)特征，確定為交鏈孢綱中的交鏈孢屬（Alternaria），容易引起新鮮大蒜發(fā)生黑斑病[26-27]。

圖1 3種致病真菌形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of three pathogenic fungi

如圖1B所示，菌絲頂端分枝形如掃帚，有橫隔，其分生孢子梗經(jīng)多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)的小梗，分生孢子呈球形、橢圓形或短柱形，光滑或粗糙。根據(jù)菌落細(xì)胞的形態(tài)特征，確定為半知菌亞門(mén)絲孢中的產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum），易引起大蒜發(fā)生黃青霉病[13]。

如圖1C所示，分生孢子梗直立、透明、光滑，分生孢子透明、光滑，多數(shù)長(zhǎng)圓形，亦有擬橢圓形、卵圓形或不規(guī)則長(zhǎng)圓形孢子，或多或少呈平行的，或不同角度的傾斜排列。根據(jù)菌落細(xì)胞形態(tài)特征，確定為青霉屬中的斜鏈擬青霉（PaecilomycescateniobliquusLiang），易引起大蒜黑霉病[13,25]。

通過(guò)鮮蒜致病微生物分離鑒定出的致病菌，結(jié)合貯藏后期鮮蒜發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)得出其發(fā)病指數(shù)，發(fā)現(xiàn)冷庫(kù)貯藏鮮蒜中交鏈孢霉的發(fā)病率最高，為69.3%，而觀測(cè)發(fā)現(xiàn)致病菌產(chǎn)黃青霉、斜鏈擬青霉在低溫冷藏條件下的發(fā)病率較低，分別為24.7%和17.9%，即控制交鏈孢霉的生長(zhǎng)能夠影響庫(kù)內(nèi)大部分鮮蒜霉變，且臭氧抑制交鏈孢屬效果已有研究表明有效[5]。為此本研究以分離純化的交鏈孢霉在不同臭氧處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)情況作比較分析，通過(guò)測(cè)量菌落在臭氧處理后的環(huán)境中生長(zhǎng)大小的直徑判定臭氧對(duì)其控制作用。

2.2 臭氧抑制鮮蒜貯藏期交鏈孢霉的研究

2.2.1 0℃下不同濃度臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長(zhǎng)的影響

由圖2可見(jiàn)，在0℃下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮蒜表面的菌落直徑呈增大的變化趨勢(shì)。整個(gè)貯藏期內(nèi)，空白對(duì)照組菌落直徑始終顯著高于臭氧處理組（P＜0.05）。可見(jiàn)與同溫度下未經(jīng)處理的空白對(duì)照組相比，臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3下處理12 h的交鏈孢霉生長(zhǎng)速度得到了明顯的抑制，且21.44 mg/m3臭氧處理組比17.152 mg/m3臭氧處理組的菌落直徑更小。所以在相同溫度（0℃）和處理時(shí)間（12 h）下，臭氧處理的濃度越大，菌落生長(zhǎng)更為緩慢，抑菌效果更好，且證實(shí)了0℃下臭氧處理對(duì)交鏈孢霉的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

圖2 0℃下不同濃度臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.2 Effects of ozone treatments with different concentrations at 0℃for 12 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.2 0℃下不同濃度臭氧處理18 h對(duì)鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長(zhǎng)的影響

如圖3所示，在0℃下，空白對(duì)照組和臭氧處理組鮮蒜表面菌落直徑在整個(gè)貯藏過(guò)程中均呈上升趨勢(shì)。其中，對(duì)照組在整個(gè)貯藏過(guò)程中菌落直徑顯著高于臭氧處理組（P＜0.05），可見(jiàn)與同溫度下未經(jīng)處理的空白對(duì)照組比較，在臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3下處理18 h的菌落生長(zhǎng)速度得到了明顯的抑制。且在相同溫度（0℃）和處理時(shí)間（18 h）下，21.44 mg/m3比17.152 mg/m3臭氧濃度處理菌落生長(zhǎng)更為緩慢，抑菌效果更好。證實(shí)了在0℃下臭氧處理對(duì)交鏈孢霉的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

圖3 0℃下不同濃度臭氧處理18 h對(duì)鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.3 Effects of ozone treatments with different concentrations at 0℃for 18 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.3 25℃下不同濃度臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長(zhǎng)的影響

由圖4可以看出，自接種第3天后，17.152 mg/m3組的菌落直徑與空白對(duì)照組出現(xiàn)差異，而21.44 mg/m3組于接種第2天后差異逐漸明顯。與同溫度下未經(jīng)處理的空白對(duì)照組相比，臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3處理12 h下交鏈孢霉的生長(zhǎng)速度得到了明顯的抑制。25℃貯藏溫度下，接種5 d后菌落迅速布滿果實(shí)表面，同時(shí)菌落創(chuàng)面軟化塌陷嚴(yán)重，已無(wú)法繼續(xù)觀測(cè)，故不再進(jìn)行量取。貯藏3 d后在相同溫度（25℃）和處理時(shí)間（12 h）下，17.152 mg/m3臭氧處理組比21.44 mg/m3組菌落直徑小，可見(jiàn)17.152 mg/m3臭氧處理組比21.44 mg/m3處理組抑菌效果更為有效。

圖4 25℃下不同濃度臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.4 Effects of ozone treatments with different concentrations at 25℃for 12 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.4 25℃下不同濃度臭氧處理18 h對(duì)鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長(zhǎng)的影響

由圖5可以看出，在25℃下，臭氧濃度為21.44 mg/m3處理18 h與同溫度下未經(jīng)處理的空白對(duì)照組菌落生長(zhǎng)情況基本一致，并未出現(xiàn)較明顯的抑制作用。同時(shí)，21.44 mg/m3臭氧處理組菌落直徑與對(duì)照組之間差異較小。而17.152 mg/m3臭氧處理組貯藏第2、4、5天的菌落直徑顯著低于其他兩組（P＜0.05）。證實(shí)臭氧熏蒸處理能抑制鮮蒜表面病斑直徑的擴(kuò)大，最終觀測(cè)菌落直徑發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在0℃下還是25℃下，17.152 mg/m3臭氧都對(duì)交鏈孢霉產(chǎn)生了抑制作用，而且這種抑制在0℃下更為明顯。

圖5 25℃下不同濃度臭氧處理18 h對(duì)鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.5 Effects of ozone treatments with different concentrations at 25℃for 18 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

3 結(jié)論與討論

由于臭氧只作用在鮮蒜表面，因此貯藏室內(nèi)存放的鮮蒜之間必須留有一定的間隙，使臭氧充分發(fā)揮作用。臭氧處理作為一種殺菌保鮮方法[28]，也有其局限性，表現(xiàn)在以下幾方面：一是當(dāng)果蔬處于密封包裝情況下，冷庫(kù)使用臭氧保鮮機(jī)保鮮時(shí)效果并不太理想；二是由于高濃度臭氧對(duì)人的眼睛、皮膚、呼吸道具有極強(qiáng)的刺激作用[29]，所以貯藏室的消毒應(yīng)在無(wú)人的情況下進(jìn)行；三是臭氧濃度并不是越高越好，臭氧使用濃度太大，會(huì)引起果蔬表面質(zhì)膜損害，使其透性增大、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，導(dǎo)致品質(zhì)下降，甚至加速果蔬的衰老和腐敗等[30]。

本試驗(yàn)從0℃下貯藏后期鮮蒜上分離鑒定出3種致病菌，分別為交鏈孢屬（Alternaria）、產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）和斜鏈擬青霉（Paccilomyces cateniobliquusLiang），且根據(jù)發(fā)病情況確定交鏈孢霉是貯藏期鮮蒜的主要致病菌。在0℃下，21.44 mg/m3臭氧處理抑制交鏈孢霉生長(zhǎng)比17.152 mg/m3臭氧處理更加明顯；而在25℃下，17.152 mg/m3臭氧處理組卻比21.44 mg/m3組抑制效果好。當(dāng)處理環(huán)境溫度相同，臭氧處理濃度也相同的情況下，處理12 h比處理18 h對(duì)霉菌的生長(zhǎng)速度抑制效果要好。且在臭氧濃度相同、處理時(shí)間也相同的情況下，0℃組比25℃組交鏈孢霉生長(zhǎng)情況得到更加明顯的抑制?？梢?jiàn)，溫度對(duì)鮮蒜上交鏈孢霉抑菌效果的影響很大。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，0℃下21.44 mg/m3臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜中主要病原菌交鏈孢霉的抑菌效果最好。