自動(dòng)染色機(jī)在病理冷凍切片染色中的應(yīng)用研究

葉美華 方慶全 張翠霞

[摘要]目的 探討自動(dòng)染色機(jī)在病理冷凍切片HE染色中的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集我院病理科2017年2月～2018年1月接收的術(shù)中冷凍切片病例100例，每例連續(xù)切片2片，固定后隨機(jī)分為兩組。甲組采用傳統(tǒng)手工染色方法染色，乙組采用自動(dòng)染色機(jī)染色，統(tǒng)計(jì)分析兩組染色的優(yōu)良率、時(shí)效性及資金投入方面的差異。結(jié)果 ①乙組的染色優(yōu)良率（98%）高于甲組（94%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②單臺(tái)冷凍切片染色時(shí)，甲組染色時(shí)間為（301.1±2.083）s，乙組為（297.2±0.186）s，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.865，P>0.05）。當(dāng)2臺(tái)冷凍切片同時(shí)染色時(shí)，甲組染色時(shí)間為（556.9±1.714）s，乙組為（495.1±0.148）s，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.92，P<0.001）。③甲組每年成本約12.4萬元；乙組每年成本約3.74萬元，乙組每年比甲組節(jié)省成本8.66萬元。結(jié)論 自動(dòng)染色機(jī)用于病理術(shù)中快速冷凍切片的HE染色效果好、效率高、成本低，值得推薦。

[關(guān)鍵詞]自動(dòng)染色機(jī)；冷凍切片；染色；成本

[中圖分類號(hào)] R361.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）11（c）-0071-03

[Abstract] Objective To investigate the application value of automatic staining machine in HE staining of pathological frozen sections. Methods 100 cases of intraoperative frozen sections who were admitted from February 2017 to January 2018 in the Department of Pathology in the First Affiliated Hospital of Xiamen University were collected， 2 continuous sections in each case. After fixation， they were randomly divided into two groups. Group A was given traditional manual staining methods. Group B was given staining by automatic staining machine. Statistical analysis was performed on the differences of the excellent rate， timeliness and capital investment of the two groups of staining. Results ①The excellent rate of staining in group B （98%） was higher than that in group A （94%）， and the difference was statistically significant （χ2=4.17， P<0.05）. ②When staining a single frozen section， the staining time in group A was （301.1±2.083） s， and that in group B was （297.2±0.186） s. There was no statistically significant difference between the two groups （t=1.865， P>0.05）. When two frozen sections were simultaneously stained， the staining time in group A was （556.9±1.714） s， and that in group B was （495.1±0.148） s. The difference between the two groups was statistically significant （t=35.92， P<0.001）. ③The annual cost in group A was about 124 000 yuan； the annual cost in group B was about 37 400 yuan. group B saved 86 600 yuan per year compared to group A. Conclusion The automatic staining machine applied to pathological intraoperative rapid frozen section has a favorable HE staining effect， high efficiency and low cost， which is worthy of recommendation.

[Key words] Automatic staining machine； Frozen sections； Staining； Cost

快速將組織冷凍成一定硬度，切出薄片的過程，稱冷凍切片[1]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，冷凍切片在組織病理學(xué)技術(shù)中有著較廣的應(yīng)用范圍[2-3]，對(duì)臨床手術(shù)的快速病理診斷具有重大意義。病理工作人員可對(duì)外科手術(shù)醫(yī)師送檢的可疑病變組織進(jìn)行快速冷凍切片染色，進(jìn)而做出初步診斷。這對(duì)外科手術(shù)醫(yī)師明確病變性質(zhì)、制定下一步的手術(shù)方案有重要的指導(dǎo)作用[4]。 近幾年隨著外科手術(shù)量的不斷增加，病理冷凍切片病例數(shù)也不斷增加。為緩解病理工作人員的工作壓力，提高工作效率與染色質(zhì)量，我科引進(jìn)了達(dá)科為（DP260）自動(dòng)染色機(jī)，承擔(dān)了冷凍切片的染色任務(wù)?，F(xiàn)將自動(dòng)染色機(jī)染色與傳統(tǒng)手工染色方法在染色優(yōu)良率、染色時(shí)效性、資金投入方面的比較進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2017年2月～2018年1月接收的術(shù)中冷凍切片病例100例，每例連續(xù)切片2片，切片厚5～6 μm，固定后隨機(jī)分為兩組。甲組采用傳統(tǒng)手工染色方法染色，乙組采用自動(dòng)染色機(jī)染色。每組各取50例進(jìn)行單臺(tái)（單例）染色，50例進(jìn)行2臺(tái)同時(shí)染色。

1.2方法

1.2.1儀器設(shè)備 達(dá)科為自動(dòng)染色機(jī)（配有17個(gè)試劑缸，4個(gè)水洗缸，1個(gè)烤片箱，1個(gè)加載站點(diǎn)，3個(gè)卸載站點(diǎn)，疏水性玻片架等）、LEICA CM1950 恒溫箱冷凍切片機(jī)（德國(guó)萊卡）、普通膠水、立式染缸數(shù)個(gè)。

1.2.2試劑 AAF液（乙酸A∶95%乙醇A∶甲醛F=5∶85∶10）[5]，Harris蘇木精，鹽酸乙醇，碳酸鋰飽和溶液，氨水，伊紅，80%乙醇，95%乙醇，100%乙醇。

1.2.3傳統(tǒng)手工染色方法流程 ①切片固定后稍水洗5 s；②蘇木精染色液染色120 s；③流水沖洗10 s；③1%鹽酸乙醇1 s；⑤水洗5 s；⑥返藍(lán)（用溫水或者1%氨水等）5 s；⑦流水沖洗30 s；⑦0.5%伊紅染色30 s；⑨流水稍洗10 s；⑩80%乙醇10 s；？輥？輯？訛95%乙醇10 s；？輥？輰？訛100%乙醇10 s；？輥？輱？訛100%乙醇10 s[6]。

1.2.4自動(dòng)染色機(jī)染色方法流程 由于自動(dòng)染色機(jī)機(jī)械臂的行進(jìn)路線存在特定的迂回性，不是單一的直線型，為了減短染色的時(shí)間，避免試劑間的交叉污染[7]，結(jié)合本科室的實(shí)際工作情況而設(shè)置了快速冷凍HE染色程序（表1）。

1.2.5染色效果判讀 由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理主管技師進(jìn)行雙盲閱片，評(píng)估冷凍切片染色效果，將切片分為優(yōu)良片和差片。優(yōu)良片評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：切片組織結(jié)構(gòu)完整，染色紅、藍(lán)分明，胞質(zhì)、胞核結(jié)構(gòu)對(duì)比清晰，透明潔凈。差片評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：切片組織結(jié)構(gòu)不完整，染色紅藍(lán)對(duì)比差，核漿模糊不清，影響術(shù)中病理診斷。

1.2.6染色時(shí)效性 染色時(shí)間均從切完片固定后開始計(jì)時(shí)，移出100%乙醇后計(jì)時(shí)結(jié)束，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.7資金投入 包括耗材支出、設(shè)備成本、人力成本。

1.3觀察指標(biāo)

比較甲組和乙組的染色優(yōu)良率、染色時(shí)效性、資金投入方面的差異。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組染色優(yōu)良率的比較

乙組的染色優(yōu)良率為98%（196/200）高于甲組的94%（188/200），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.17，P<0.05）。

2.2兩組染色時(shí)效性的比較

單臺(tái)冷凍切片染色時(shí)，兩組的染色時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.865，P>0.05）。當(dāng)2臺(tái)冷凍切片同時(shí)染色時(shí)，乙組的染色時(shí)間短于甲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.92，P<0.001）（表2）。

2.3兩組資金投入方面的比較

本科室所有冷凍切片的染液均自主配制，甲、乙兩組每年耗材支出均約為4000元。甲組無儀器設(shè)備投入，但同一時(shí)段多臺(tái)冷凍切片染色時(shí)要多一個(gè)人力成本，每年成本約12萬元，加上耗材支出，共計(jì)12.4萬元；乙組自動(dòng)染色機(jī)成本20萬元，按6年折舊，每年成本約3.34萬元，加上耗材支出，共計(jì)3.74萬元。乙組每年比甲組節(jié)省成本8.66萬元。

3討論

1818年P(guān)ieter de Riemer 發(fā)明了冷凍切片技術(shù)，直至1905年Wilson Mecarty 將其列為病理學(xué)診斷方法之一[8]。如今，冷凍切片技術(shù)在病理診斷工作中具有舉足輕重的作用[9-11]，冷凍切片技術(shù)是術(shù)中快速病理診斷的基石，術(shù)中快速病理診斷是病理科醫(yī)師最具風(fēng)險(xiǎn)的急診工作[12]， 如何在限定的時(shí)間內(nèi)既快又好地完成制片，不僅是病理醫(yī)師做出正確診斷的需要，更是術(shù)中臨床醫(yī)師的迫切要求[13]。而快速冷凍染色技術(shù)是冷凍切片技術(shù)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，染色質(zhì)量好壞直接關(guān)系到病理醫(yī)師診斷的準(zhǔn)確率。傳統(tǒng)手工染色會(huì)因溫度高低、試劑濃度、染色時(shí)間長(zhǎng)短、環(huán)境、不同操作者等因素而使得胞質(zhì)、胞核染色深淺不一，對(duì)比不均；自動(dòng)染色機(jī)可預(yù)先設(shè)好染色時(shí)間和程序，使每一批次的染色步驟和時(shí)間能保持一致，染色后組織結(jié)構(gòu)完整，著色鮮艷，紅、藍(lán)分明，核質(zhì)對(duì)比清晰，染色均勻，而且省時(shí)省力[14]。此外，全自動(dòng)染色機(jī)在密閉空間內(nèi)完成染色過程，減少了試劑的揮發(fā)，減輕對(duì)病理科工作人員的化學(xué)危害[15]。

隨著醫(yī)院手術(shù)室規(guī)模的擴(kuò)大，手術(shù)臺(tái)數(shù)不斷增加，冷凍切片數(shù)也不斷增多。實(shí)際工作中，經(jīng)常會(huì)遇到在同一時(shí)間段接收多份冷凍標(biāo)本的狀況。大多數(shù)醫(yī)院的病理科，一般只有一個(gè)技術(shù)員承擔(dān)冷凍切片制片的任務(wù)，當(dāng)同時(shí)接收多份標(biāo)本時(shí)，該技術(shù)員將無法在規(guī)定時(shí)間（15 min）內(nèi)完成所有的冷凍切片，這就需要另一技術(shù)員的協(xié)助，即一個(gè)技術(shù)員制片，一個(gè)技術(shù)員染色。然而即便如此，冷凍制片時(shí)間延長(zhǎng)的情況也時(shí)有發(fā)生。使用自動(dòng)染色機(jī)后，技術(shù)員使用統(tǒng)籌方法，在染色機(jī)進(jìn)行染色期間，可進(jìn)行下一個(gè)患者冷凍組織的速凍和切片，再將切完固定好的冰凍切片上機(jī)，而后再將上一個(gè)染好的冷凍切片取出，完成電吹風(fēng)吹干、中性樹膠封片及核對(duì)、貼標(biāo)簽等后續(xù)工作。這樣，技術(shù)員可及時(shí)處理同一時(shí)間段送來的批量標(biāo)本，病理醫(yī)師就能及時(shí)、準(zhǔn)確地發(fā)出冷凍快速病理報(bào)告。這對(duì)縮短手術(shù)等候時(shí)間，快速確定手術(shù)方案，減輕患者痛苦有著重要意義。

隨著病理實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制管理的深入，對(duì)冷凍切片染色的質(zhì)量要求也越來越高。達(dá)科為自動(dòng)染色機(jī)自帶質(zhì)控功能，為冷凍切片染色的質(zhì)量控制提供便利和幫助[16]。但在實(shí)際運(yùn)行中，由于冷凍切片制片的時(shí)限性，我科質(zhì)控人員必須得先做質(zhì)控，即先試染一張切片，然后顯微鏡下觀察染色質(zhì)量，以確保試劑處于有效的染色狀態(tài)，不能完全依賴機(jī)器自帶的質(zhì)控功能。一旦試染片染色質(zhì)量不佳，質(zhì)控人員就得查出具體原因，及時(shí)更換染色試劑，并做好相關(guān)記錄，確保高質(zhì)量染色的正常運(yùn)行，為后續(xù)工作做好充分的準(zhǔn)備。質(zhì)量控制做好了，就可以避免由染色不佳導(dǎo)致反復(fù)制片所造成的時(shí)間延誤。要制作一張優(yōu)良的冷凍切片，有賴于病理科技術(shù)員在工作中不斷積累經(jīng)驗(yàn)，提升自身的業(yè)務(wù)水平。

自動(dòng)染色機(jī)在實(shí)際工作中也存在不足，即當(dāng)同一染色機(jī)上多批次進(jìn)行染色時(shí)，由于染色缸的使用及機(jī)械臂的起落時(shí)間會(huì)發(fā)生沖突，會(huì)導(dǎo)致出片時(shí)間拖延。為了加快染色速度，當(dāng)染色批次>4次時(shí)，應(yīng)考慮再增加一臺(tái)自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行染色。機(jī)器每次使用完畢，須及時(shí)蓋上缸蓋，以有效避免試劑揮發(fā)，并定期進(jìn)行保養(yǎng)和清潔。

綜上所述，自動(dòng)染色機(jī)的染色效果相對(duì)穩(wěn)定，操作方便，可承擔(dān)批量冷凍切片染色任務(wù)，有效減輕病理技術(shù)工作人員的負(fù)擔(dān)，極大節(jié)省工作中的人力成本，節(jié)約時(shí)間資源，提高工作效率。

[參考文獻(xiàn)]

[1]丁偉，王德田，董建強(qiáng)，等.簡(jiǎn)明病理學(xué)技術(shù)[M].杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，2014：46.

[2]張紅紅.冷凍切片與術(shù)中細(xì)胞學(xué)診斷卵巢腫瘤的對(duì)比研究[J].中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2016，7（11）：185-186.

[3]Sala P，Morotti M，Menada MV，et al.Intraoperative frozen section risk assessment accurately tailors the surgical staging in patients affected by early-stage endometrial cancer：the application of 2 different risk algorithms[J].Int J Gynecol Cancer，2014，24（6）：1021-1026.

[4]肖海波，王淑華，吳震.影響術(shù)中冷凍切片診斷正確率的臨床及病理因素分析[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2015，13（15）：60-62.

[5]張翠霞，方慶全，陳世東.甲狀腺冷凍切片速凍方法的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2017，8（23）：139-141.

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊(cè)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2010：38.

[7]王偉，施公勝，劉益飛.自動(dòng)染色機(jī)應(yīng)用于快速冰凍切片染色的可行性探討[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，30（6）：489-490.

[8]Bianchi S，Palli D，Ciatto S，et al.Accuracy and reliability of frozensection diagnosis in a series of 672 nonpalpable breast lesions[J].Am J Clin Pathol，1995，103（2）：199-205.

[9]張海巍.甲狀腺微小乳頭狀癌的術(shù)中冰凍病理診斷分析[J].中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2016，7（36）：159-161.

[10]黃波濤，林秀峰，朱云，等.甲狀腺微小乳頭狀癌的冷凍病理特征與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J].診斷病理學(xué)雜志，2016，23（6）：444-447.

[11]胥維勇.冷凍切片自動(dòng)染色機(jī)的應(yīng)用[J].2013，42（7）：471-472.

[12]王雙珠，王敏.制作婦科標(biāo)本冷凍切片的常見問題及處理方法[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2015，31（9）：1064-1065.

[13]薛曉偉，孫保存，王偉，等.首屆全國(guó)病理技術(shù)“華夏杯”冷凍 切片總決賽結(jié)果分析[J].中華病理學(xué)雜志，2016，45（6）：413-414.

[14]羅小平，李廣民，胡維維.自動(dòng)染片機(jī)在HE染色中的應(yīng)用及與手工染色的比較[J].診斷病理學(xué)雜志，2007，14（3）：179-179，189.

[15]張鵬，包磊，任麗芳，等.全自動(dòng)染色機(jī)與手工染色的比較及其染色程序的改進(jìn)[J].臨床和實(shí)醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（2）：224-225.

[16]于芳，李純.Dakewe DP260全自動(dòng)智能染色機(jī)在細(xì)胞染色中的使用體會(huì)[J].診斷病理學(xué)雜志，2017，24（3）：205，209.