利拉魯肽對2型糖尿病非酒精性脂肪肝病小鼠的作用研究

邢冬杰 宿世震 陳桂玉 張彩坤 宋桂紅 劉曉慶

[摘要]目的 探討利拉魯肽對2型糖尿病非酒精性脂肪肝病的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 選取50只小鼠，隨機(jī)分為正常對照組（15只）和高糖高脂飼料組（35只），采用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素的方法，建立2型糖尿病非酒精性脂肪肝病的小鼠模型，經(jīng)處理分為正常對照組、模型對照組、利拉魯肽組，每組10只。利拉魯肽皮下注射8周，觀察各組空腹血糖（FBG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性、胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）及肝指數(shù)等指標(biāo)；檢測肝組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）的水平；采用HE染色及油紅“O”染色觀察肝組織病理改變；采用免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（BaX）的表達(dá)。結(jié)果 與正常對照組比較，模型對照組大鼠的FBG、FINS、HOMA-IR增高，血清TG、TC、ALT、AST含量升高，肝指數(shù)增高，肝組織中SOD活性降低、MDA含量升高、TNF-α及IL-8水平上升，HE染色、油紅“O”染色肝組織中脂肪性變明顯，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，BaX蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01，P<0.05）。與模型對照組比較，利拉魯肽組的FBG、TG、TC、ALT、AST含量降低，HOMA-IR及肝指數(shù)下降；肝組織中SOD活性升高，MDA含量及TNF-α、IL-8水平下降（P<0.01）；HE染色、油紅“O”染色肝組織中脂肪性變明顯減輕，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加，BaX蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）。結(jié)論 利拉魯肽對2型糖尿病非酒精性脂肪肝病的小鼠肝臟具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用、減少炎癥因子的表達(dá)及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、BaX的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]2型糖尿?。环蔷凭灾靖尾?；利拉魯肽；B淋巴細(xì)胞瘤-2；Bcl-2相關(guān)X蛋白

[中圖分類號] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）11（c）-0012-05

[Abstract] Objective To explore the protective effect and mechanism of Liraglutide on non-alcoholic fatty liver disease in mice with type 2 diabetes mellitus. Methods A total of 50 mice were selected and randomly divided into normal control group （n=15） and high-suger and high-fat diet group （n=35）. A non-alcoholic fatty liver disease model of type 2 diabetes mellitus by high-sugar and high-fat diet combined with low-dose streptozotocin was established. The mice were divided into the normal control group， the model control group， and the liraglutide group after treatment， with 10 cases in each group. Liraglutide was injected subcutaneously for 8 weeks. Fast blood glucose （FBG）， alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST）， insulin （FINS）， insulin resistance index （HOMA-IR） and liver index were observed in each group. The level of SOD， MDA， TNF-α， IL-8 in liver tissue were detected. HE staining and oil red “O” staining were used to observe the pathological changes of liver tissue. Immunohistochemistry was used to detect the expression of B-lymphoma-2 （Bcl-2） and Bcl-2 related X-protein （BaX） in liver tissue. Results Compared with the normal control group，the level of FBG， FINS and HOMA-IR in model control group increased， the level of serum TG， TC， ALT， AST content increased， the level of liver index increased， SOD activity decreased， MDA content increased， TNF-α and IL-8 levels increased， HE staining and oil red “O” staining in liver tissue fatty change was obvious， Bcl-2 protein expression significantly decreased， and BaX protein expression increased significantly （P<0.01， P<0.05）. Compared with the model control group， the contents of FBG， TG， TC， ALT， AST， HOMA-IR and liver index decreased， SOD activity increased， MDA content， TNF-α and IL-8 decreased in the Liraglutide group （P<0.01）. HE staining and oil red “O” staining significantly reduced fatty degeneration， the expression of Bcl-2 protein significantly increased and the expression of BaX protein significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Liraglutide has protective effects on the liver of non-alcoholic fatty liver disease in mice with type 2 diabetes. The mechanism may be related to anti-oxidation， reducing the expression of inflammatory factors and regulating the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and BaX.

[Key words] Type 2 diabetes； Non-alcoholic fatty liver disease； Liraglutide； B-cell lymphoma-2； Bcl-2 associated X protein

近年來，糖尿病非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率日益升高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）的NAFLD發(fā)病率達(dá)34%～74%，特別是伴有肥胖的T2DM，NAFLD發(fā)病率幾乎為100%[1-2]，因此，明確T2DM合并NAFLD的發(fā)病機(jī)制以及尋求有效的藥物，對防治T2DM合并NAFLD具有重要意義。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1受體激動劑類藥物，具有降低血糖、血脂、減輕體重、改善胰島素抵抗等作用[3-4]，其作為新的降糖藥物已廣泛應(yīng)用于T2DM的臨床治療。新近研究顯示[5]，利拉魯肽對肝臟具有保護(hù)作用，可以降低NAFLD大鼠的三酰甘油（triglyceride，TG）、膽固醇（cholesterol，TC）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）的水平。為了深入研究利拉魯肽獨(dú)立于降糖之外的作用，本研究通過高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素建立T2DM合并NAFLD小鼠模型，給予利拉魯肽干預(yù)治療8周，觀察利拉魯肽對肝臟的保護(hù)作用和及其機(jī)制，為其臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 KM小鼠，6周齡，SPF級，雄性，體質(zhì)量18～23 g，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK（魯）20130009。

1.1.2藥物與試劑 利拉魯肽為丹麥諾和諾德公司生產(chǎn)，批號為S20160020；高糖高脂飼料（10%豬油、10%蔗糖、2%膽固醇、10%蛋黃粉、68%基礎(chǔ)飼料）同江蘇協(xié)同生物有限公司提供，批號為201609012；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ），由Sigma公司國內(nèi)分裝，批號為S0132；TG、TC、ALT、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、考馬斯亮藍(lán)蛋白、丙二醛（malondialdehyde，MDA）購自南京建成生物科技有限公司，批號分別為20170218、20170311、20170215、20170321、20170221、20170308、20170319；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素-8（interleukin -8，IL-8）、游離胰島素（free insulin，F(xiàn)INS）購自南京曉勱生物科技有限公司，批號為20170308、20170322、20170328；B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體及Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 -assaciated xprotein，Bax）抗體由Santa cruz提供，批號為20170326；根過氧化物酶購自碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為122115160419。

1.1.3儀器 微量血糖儀及配套試紙（德國羅氏診斷公司，活力型）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司，L-530）；全自動生化分析儀（雅培，CTi16000）；冰凍切片機(jī)（德國leica，CM1860）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司，TS-100）；智能放免r測量儀（上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠，SN-695B型）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，5300型）等。

1.2方法

1.2.1模型制備 50只小鼠，室溫22～25℃，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組（15只）與高糖高脂飼料組35只。正常對照組普通飼料喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，高糖高脂飼料組喂養(yǎng)8周后，STZ溶液200 mg/kg腹腔注射，正常對照組注射枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后測定高糖高脂飼料組的FBG，初測FBG≥16.5 mmol/L并穩(wěn)定5 d，復(fù)測16.7 mmol/L≤FBG≤25.0 mmol/L為T2DM成模小鼠，共入選25只，余剔除。從正常對照組與T2DM成模小鼠中各隨機(jī)選取2只處死，取血測定TC、TG、ALT、AST，取肝組織HE染色，證實(shí)NAFLD模型復(fù)制成功[6-7]。

1.2.2分組及給藥方法 從NAFLD模型小鼠隨機(jī)選取20只分為模型對照組和利拉魯肽組（100 μg/kg），每組10只。利拉魯肽組給予利拉魯肽皮下注射，每日1次，持續(xù)8周；正常對照組（隨機(jī)選取10只）與模型對照組小鼠給予相應(yīng)體積的生理鹽水。皮下注射時間均為每日下午16：00，每周定期測量各組小鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。

1.2.3指標(biāo)檢測 ①血清指標(biāo)檢測：末次給藥后所有小鼠禁食不禁水空腹過夜，測量體質(zhì)量后予以戊巴比妥鈉腹腔麻醉后剪尾取血，采用微量血糖儀檢測FBG；心臟取血，離心（3000 r/min）15 min取血清，全自動生化分析儀檢測TG、TC、ALT、AST，采用放免法測定FINS，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR=FBG×FINS/22.5）。②肝指數(shù)：取血后迅速剖腹取肝臟，生理鹽水沖洗、濾紙吸干后測定肝濕重，肝濕重/體質(zhì)重×l00%=肝指數(shù)。③肝組織SOD、MDA、TNF-α、IL-8檢測：取肝臟右葉肝組織0.5 g剪碎，冰浴下研磨制備組織勻漿，離心后吸取上清液待測。④肝組織HE染色、油紅“O”染色：于肝左葉內(nèi)側(cè)取小塊肝組織，置于蔗糖中待做冰凍切片及油紅“O”染色，再取小塊肝組織至于10%中性甲醛固定液中固定，石蠟包埋制備切片及HE染色，觀察肝組織病變情況。⑤免疫組化法檢測凋亡蛋白Bcl-2/BaX的表達(dá)情況：石蠟切片脫蠟后，純化水沖洗，PBS浸泡5 min，EDTA抗原修復(fù)；H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗，4℃一抗過夜，PBS沖洗，二抗，DAB顯色劑顯色，鏡下觀察測量，細(xì)胞漿有棕黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景非特異染色者為陽性細(xì)胞，取平均光密度值（IOD）表示相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法，不符合正態(tài)分布首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比較

與正常對照組比較，模型對照組小鼠的FBG、FINS、HOMA-IR顯著升高（P<0.01）；與模型對照組比較，利拉魯肽組的FBG、FINS、HOMA-IR明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2各組小鼠TG、TC、ALT、AST、肝指數(shù)的比較

與正常對照組比較，模型對照組小鼠的TG、TC、ALT、AST、肝指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型對照組比較，利拉魯肽組的TG、TC、ALT、AST、肝指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2）。

2.3各組小鼠肝組織SOD、MDA、TNF-α、IL-8的比較

與正常對照組比較，模型對照組大鼠的SOD活性降低，MDA含量、TNF-α及IL-8水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型對照組比較，利拉魯肽組的SOD活性明顯升高，MDA含量、TNF-α及IL-8水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表3）。

2.4各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果的比較

與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝組織內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的脂肪空泡，細(xì)胞核被擠向周邊，部分可見散在壞死灶及炎性細(xì)胞浸潤。與模型對照組比較，利拉魯肽組小鼠肝臟組織病變減輕，胞漿脂滴明顯減小，肝細(xì)胞排列整齊，脂肪變性程度輕（圖1）。

2.5各組小鼠肝組織油紅“O”染色結(jié)果的比較

與正常對照組比較，模型對照組脂滴多且廣泛分布在肝臟組織胞漿中；與模型對照組比較，利拉魯肽組脂滴明顯減少（圖2）。

2.6各組小鼠肝組織Bcl-2及BaX表達(dá)的比較

三組小鼠肝臟中均有Bcl-2、BaX的表達(dá)，與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝臟中的Bcl-2表達(dá)弱，平均光密度值降低，BaX表達(dá)增強(qiáng)，平均光密度值升高，Bcl-2/BaX的比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型對照組相比，利拉魯肽組肝臟中的Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，平均光密度值降低，BaX表達(dá)明顯降低，平均光密度值降低，Bcl-2/BaX的比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖3、表4）。

3討論

目前認(rèn)為，糖尿病合并NAFLD的發(fā)病機(jī)制是“二次打擊學(xué)說”，胰島素抵抗（IR）是NAFLD發(fā)病的初次打擊，引起肝細(xì)胞脂肪堆積，肝的結(jié)構(gòu)和功能受損[8]；氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化作用是第二次打擊，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[9]。IR是T2DM和NAFLD的共同病理生理基礎(chǔ)，改善IR，改善糖脂代謝紊亂、脂質(zhì)過氧化是T2DM合并NAFLD防治領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[10-11]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組小鼠的FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、ALT、AST、肝指數(shù)明顯升高，肝臟脂肪變性程度顯著增高，差異有顯著性，提示模型成立，與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相符[12-13]。利拉魯肽組小鼠的FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、ALT、AST、肝指數(shù)均呈現(xiàn)下降，病理結(jié)果顯示脂肪性變減輕，提示利拉魯肽對T2DM合并NAFLD小鼠具有降脂保肝作用。

糖尿病發(fā)病過程中，在體內(nèi)高糖的狀態(tài)下，活性氧簇及活性氮簇生成過多，超過機(jī)體清除能力而導(dǎo)致氧化應(yīng)激[14-15]。SOD可反映機(jī)體或細(xì)胞抗氧化的能力，MDA可間接反映機(jī)體受氧自由基攻擊的程度，因此通過測定體內(nèi)SOD、MDA水平，能夠反映機(jī)體組織的氧化-抗氧化狀態(tài)[16]。氧化反應(yīng)啟動，導(dǎo)致線粒體DNA破壞、炎癥細(xì)胞因子釋放，TNF-α、IL-8可加速TG在肝細(xì)胞的合成并促進(jìn)脂肪酸聚集，使脂肪酸的氧化受到抑制，導(dǎo)致蛋白酶加速分泌和炎細(xì)胞浸潤及大量氧化產(chǎn)物產(chǎn)生，對肝臟造成二次打擊，促進(jìn)NAFLD進(jìn)一步加重[17-18]。本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組小鼠肝組織中的SOD活性下降，MDA、TNF-α、IL-8水平升高，利拉魯肽組小鼠肝組織中的SOD活性升高，MDA、TNF-α、IL-8水平下降，提示利拉魯肽能減輕小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平，提高其抗氧化能力，并降低其炎癥水平。

Bcl-2和BaX是細(xì)胞凋亡中極其重要的2個調(diào)控基因，前者抑制凋亡，后者促發(fā)凋亡，而Bcl-2/Bax比值決定著凋亡信號刺激后細(xì)胞的存活狀態(tài)[19-20]。本實(shí)驗(yàn)中，與模型對照組比較，利拉魯肽能顯著增加小鼠肝細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)、減少肝細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)，提示利拉魯肽可上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax蛋白，提高Bcl-2/Bax比值，對肝細(xì)胞凋亡有抑制作用。

綜上所述，利拉魯肽對T2DM合并NAFLD的小鼠肝臟具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用、減少炎癥因子的表達(dá)及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，BaX的表達(dá)有關(guān)，有可能成為T2DM合并NAFLD新的治療藥物。

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