基于PCR-DGGE與高通量測序技術(shù)的恩施地區(qū)臘魚細(xì)菌多樣性評價(jià)

王玉榮，廖華，趙慧君，張振東，郭壯,3

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽 441053）

（2.恩施市農(nóng)業(yè)局，湖北恩施 445000）（3.恩施市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北恩施 445000）

恩施土家苗族自治州地處湖北省西南部，緊鄰湘、渝，由大巴山、巫山、齊岳山和武陵山等山脈環(huán)繞而成，境內(nèi)地勢復(fù)雜，河谷深切，河流較多且生活著漢族、土家族和苗族等27個(gè)民族，少數(shù)民族文化多姿多彩，傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作技藝更是不勝枚舉[1,2]。該地生產(chǎn)的臘魚主要以境內(nèi)野生草魚或是農(nóng)家自養(yǎng)鮮魚為原料進(jìn)行腌制，又因恩施自治州屬亞熱帶季風(fēng)性山地濕潤氣候，環(huán)境較為潮濕，當(dāng)?shù)厝藢㈦缰坪蟮呐D魚用松柏枝進(jìn)行煙熏，該方法不僅可以延長臘魚保質(zhì)期還能有效改善成品風(fēng)味。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的構(gòu)成不僅影響了產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)，同時(shí)其含有的一些條件致病菌亦可能存在一定安全隱患，因而對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物多樣性進(jìn)行解析則顯得尤為重要。國內(nèi)研究人員對臘魚中微生物進(jìn)行了多項(xiàng)研究，且大多采用純培養(yǎng)的手段并從中檢測出多種微生物，如酵母菌[3,4]、乳酸菌[5～7]、葡萄球菌[8]和微球菌[9]等。由于純培養(yǎng)技術(shù)的局限性，一些非純培養(yǎng)的手段逐漸被應(yīng)用到臘魚微生物研究中，吳燕燕采用MiSeq測序技術(shù)研究了腌干魚在不同加工階段的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變性菌門（Proteobacteri）為腌干魚加工過程主要微生物[10]；錢茜茜采用宏基因組技術(shù)對不同加工階段腌干魚中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)整個(gè)加工體系主要微生物亦為Bacteroidetes、Firmicutes和 Proteobacteria[11]。然而目前有關(guān)恩施地區(qū)產(chǎn)臘魚微生物多樣性的研究尚未見報(bào)道。

鑒于恩施特殊的地理環(huán)境與當(dāng)?shù)嘏D腸制作工藝的開放性與特殊性，本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）與MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法對該地生產(chǎn)的臘魚樣品中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了全面解析，以期為提高恩施地區(qū)臘魚品質(zhì)的穩(wěn)定性和安全性提供一定數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

主要試劑：尿素、聚丙烯酰胺、N,N-亞甲基二丙烯酰胺、過硫酸銨、冰醋酸、甲醛、硝酸銀、乙醇和十六烷基三甲基溴化銨購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；QIAGEN DNeasymericon Food Kit提取試劑盒，購于德國 QIAGEN 公司；10×PCR Buffer、dNTPs Mix、DNA聚合酶、pMD18-T vector和SolutionI，寶生物工程（大連）有限公司；Loading buffer、DL2000和DL15000 DNA Marker，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×PCR mix，購于南京諾唯贊生物科技有限公司；Axygen清潔試劑盒，購于北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室制備。引物338F/806R（正向引物中加入7個(gè)核苷酸標(biāo)簽）、ALL-GC-V3F/ALL-V3R、ALL-V3F/ALL-V3R和M13F（-47）/M13R（-48）購于武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。各引物序列如表1所示。

表1 引物名稱和序列信息Table 1 Primer name and sequence information

主要設(shè)備：HBM-400B拍擊式無菌均質(zhì)器，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)，美國Nano Drop公司；DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠；VeritiTM96孔梯度 PCR擴(kuò)增儀，美國AB公司；DCodeTMSystem，美國 Bio-Rad公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；MiSeq PE300高通量測序平臺，美國Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器，美國DELL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

從湖北省恩施市舞陽壩菜市場（109.47°N，30.3°E）采集5個(gè)臘魚樣品分別置于無菌采樣袋中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。只有符合下列條件的樣品才可納入采集的范圍：（1）臘魚由草魚制作；（2）臘魚無肉眼可見雜質(zhì)、寄生蟲和蟲卵；（3）臘魚無病變、霉變和酸敗等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象；（4）臘魚的制作地點(diǎn)需在恩施市范圍內(nèi)。

1.2.2 樣品前處理及宏基因組DNA提取

取25 g切碎的臘魚加入225 mL無菌生理鹽水后置于拍擊器中拍擊3 min，取出置于冷凍離心機(jī)中300 r/min離心10 min保留上清液，上清液以10000 r/min離心10 min以便收集菌體，然后使用商業(yè)試劑盒提取臘魚樣品微生物宏基因組DNA。

1.2.3 基因組DNA檢測

使用1%的瓊脂糖凝膠電泳以DL15000 Maker為參照查看是否擴(kuò)增出清晰明亮大小合適的目的條帶。然后以無菌超純水為參照，取1 μL提取DNA置于微量紫外分光光度計(jì)檢測口檢測其 OD260/280是否在1.8～2.0之間并確定各樣品DNA濃度。用無菌超純水將檢測合格的樣品宏基因組DNA濃度統(tǒng)一稀釋至30 ng/μL 備用。

1.2.4 細(xì)菌DGGE指紋圖譜分析

細(xì)菌 PCR擴(kuò)增時(shí)使用引物對為 ALL-GC-V3F/ALL-V3R，擴(kuò)增體系中各試劑添加量及循環(huán)條件參照文獻(xiàn)15中的方法略做改動：細(xì)菌PCR擴(kuò)增體系為50 μL，模板量為1 μL，退火溫度（Tm）為55 ℃。擴(kuò)增結(jié)束后使用1.2.2中的方法檢測擴(kuò)增效果。在檢測合格的體系中加入6 μL Loading buffer混勻置于-20 ℃?zhèn)溆?。DGGE凝膠中變性劑范圍為 35%～52%，待電泳槽中緩沖溶液的溫度升至 60 ℃時(shí)在每個(gè)膠孔中加入10 μL混有Loading buffer的PCR產(chǎn)物，先120 V電泳76 min使樣品穿過上層膠后80 V維持13 h然后采用銀染法染色。取優(yōu)勢條帶回溶溶液2 μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為 25 μL：正反向引物ALL-V3F/ALL-V3R 各0.5 μL，2×PCR mix 12.5 μL，剩余體積用無菌超純水補(bǔ)齊。擴(kuò)增循環(huán)條件及檢測方法同上。參照楊春麗的方法將清潔后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接PMD18-T載體[16]，并采用熱激法[17]將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌Top10中，挑選陽性克隆送去測序。

1.2.5 細(xì)菌MiSeq高通量測序分析

首先對細(xì)菌16s rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)18中所描述的進(jìn)行操作。擴(kuò)增合格的DNA使用干冰寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行MiSeq高通量測序。參照蔡宏宇[19]的方法對返回的序列進(jìn)行質(zhì)量控制并根據(jù)核苷酸標(biāo)簽（barcode）區(qū)分序列來源。然后利用 QIIME（v1.7.0）分析平臺[20]對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析：采用UCLUST法[21]劃分分類操作單元（Operational taxonomic units，OTU），使用RDP（Ribosomal Database Project）[22]和 Greengenes[23]數(shù)據(jù)庫對 OTU中各代表性序列進(jìn)行同源性比對確定其微生物分類地位，使用超 1（Chao1）指數(shù)和香濃（Shannon）指數(shù)分析臘魚樣品中細(xì)菌多樣性。

1.2.6 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用BioEdit 7.0.9和Mega7.0處理DGGE序列并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，使用OriginPro 2017軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌DGGE指紋圖譜分析

PCR-DGGE技術(shù)可有效區(qū)分長度相同但堿基存在差異的序列從而直觀反映樣品中微生物多樣性及各樣品中微生物差異[24]。本研究首先采用 PCR-DGGE技術(shù)對恩施臘魚樣品中細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，分析結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在DGGE指紋圖譜中5個(gè)樣品呈現(xiàn)出明亮不一的條帶，其中條帶ALY2和條帶ALY6為所有樣品中共有條帶且條帶較明亮，說明 ALY2和ALY6為樣品中共有細(xì)菌且含量較高；條帶 ALY1、ALY3、ALY4和ALY5為某些樣品中特有條帶，且在不同樣品中條帶亮度不同，說明各樣品中都含獨(dú)特細(xì)菌且同種細(xì)菌在不同樣品間含量存在差異。值得一提的是，樣品LY1中條帶數(shù)量和亮度明顯低于其他樣品，說明該樣品中細(xì)菌豐度和多樣性均不及其他樣品。本研究進(jìn)一步將6條輪廓清晰的優(yōu)勢條帶回收后擴(kuò)增的序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果如圖2所示。

圖2 優(yōu)勢條帶序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of dominant band sequences

由圖2可知，條帶ALY1、ALY2和ALY3與北極冷桿菌（Psychrobacterarcticus）和水棲冷桿菌（Psychrobacterglacincola）形成一個(gè)聚類，而ALY4、ALY5和 ALY6與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）形成一個(gè)聚類。由此可見，雖然利用 PCR-DGGE技術(shù)無法將各條帶鑒定到種水平，究其原因可能與引物擴(kuò)增區(qū)域較短有關(guān)，但不難發(fā)現(xiàn)臘魚樣品中的微生物以嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主。曾令彬采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段對臘魚加工中微生物進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢微生物菌群為乳酸菌、微球菌、葡萄球菌和酵母菌[9]，其研究結(jié)論與本研究存在一定的差異性，這可能是由于原料種類、地域以及傳統(tǒng)微生物學(xué)手段的限制等因素造成的。值得一提的是，王建建研究發(fā)現(xiàn)野生銀鯧消化道內(nèi)主要菌群為嗜冷菌屬（Psychrobacter），而養(yǎng)殖銀鯧消化道主要菌群為不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單孢菌屬（Pseudomonas）[25]。此外，楊紅玲研究發(fā)現(xiàn)石斑魚腸道原籍Psychrobactersp.SE6能抑制多種常見病原菌的生長，且能顯著提高石斑魚餌料利用率并增加其免疫力[26]。由此可見，恩施地區(qū)臘魚樣品中的嗜冷桿菌屬可能主要來源于原料本身。

2.2 細(xì)菌MiSeq高通量測序分析

圖3 細(xì)菌門水平平均相對含量餅圖Fig.3 The pie chart of average relative content of bacterial phyla

相對于基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物手段以及DGGE指紋圖譜技術(shù)，以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術(shù)可檢測到樣品中低豐度的菌群，從而能夠更加真實(shí)準(zhǔn)確的反映樣本微生物多樣性[27]。本研究采用 MiSeq高通量測序技術(shù)從 5個(gè)樣品中共檢測出84721條合格序列，采用α多樣性對序列進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)在測序深度為29910條序列時(shí)LY1、LY2、LY3、LY4和LY5的Chao1指數(shù)分別為574、1085、1149、843和1096，Shannon指數(shù)分別為2.65、4.35、6.62、5.76和4.86，說明LY1中的細(xì)菌總數(shù)和豐富度最低而LY3中的最高，這與DGGE分析結(jié)果相同。在97%的相似度下可將質(zhì)檢合格的序列劃分至 6733個(gè) OTU中，從每個(gè) OTU中挑選代表性序列與數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，所有樣品共檢測出18個(gè)細(xì)菌門，將相對含量大于1.0%的定義為優(yōu)勢菌門，各優(yōu)勢菌門分析結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，臘魚樣品中優(yōu)勢細(xì)菌門主要為變形菌門（Proteobacteria）、硬壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），其平均相對含量分別為 61.29%、30.21%、5.34%和1.74%。值得一提的是LY4中Firmicutes的相對含量高達(dá) 80.20%，LY2中 Firmicutes的相對含量僅為6.14%，LY1和LY3中Proteobacteria和Firmicutes的相對含量較為相近。吳燕燕[10]和錢茜茜[11]的研究均表明腌干魚加工過程中主要微生物為 Bacteroidetes、Firmicute和Proteobacteria，其研究結(jié)果與本研究相同。

本研究進(jìn)一步從屬水平上分析細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)從LY1、LY2、LY3、LY4和LY5中檢測到的細(xì)菌屬數(shù)量分別為27個(gè)、227個(gè)、133個(gè)、136個(gè)和53個(gè)，僅有3.93%的序列不能鑒定到屬水平。所有細(xì)菌屬中平均相對含量大于0.1%的有32個(gè)，大于1.0%的有8個(gè)，現(xiàn)將平均相對含量大于1.0%的細(xì)菌屬定義為優(yōu)勢菌屬，則各優(yōu)勢菌屬分析結(jié)果如圖4所示。

圖4 優(yōu)勢細(xì)菌屬平均相對含量餅圖Fig.4 The pie chart of average relative content of dominant bacteria genus

由圖4可知，恩施臘魚中的優(yōu)勢細(xì)菌屬及其平均相對含量分別為嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，35.70%）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix，19.74%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，7.13%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，7.12%）、不動細(xì)菌屬（Acinetobacter，4.19%）、弧菌屬（Vibrio，3.90%）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas，3.09%）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium，1.98%），這些優(yōu)勢細(xì)菌屬的累積平均相對含量高達(dá) 82.84%，但Pseudomonas、Acinetobacter、Vibrio和Chryseobacterium在LY1中沒有檢出，Chryseobacterium在LY5中亦沒有檢出。作為兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，環(huán)絲菌屬（Brochothrix）細(xì)菌可以在低氧和4 ℃生長繁殖，是冷卻豬肉中主要的一種污染菌[28]。本研究采集臘魚樣品中亦含有7.12%的葡萄球菌（Staphylococcus），該菌廣泛的分布于自然環(huán)境且多數(shù)為非致病菌，但作為人類化膿感染中最常見的病原菌，隸屬于該屬的金黃色葡萄球菌（S. aureus）可在加工、貯藏和運(yùn)輸過程中對食品造成污染[29]。值得一提的是，高通量測序技術(shù)亦檢測出樣品中含有Lactobacillus（平均相對含量為0.83%）而 DGGE技術(shù)未檢測出Brochothrix、Pseudomonas和Staphylococcus等優(yōu)勢菌屬以及其他相對含量更低的細(xì)菌屬，這可能是由于DGGE擴(kuò)增引物、變性劑范圍以及該技術(shù)的檢測限較低等因素引起的。本研究進(jìn)一步對 OTU在各樣品中出現(xiàn)次數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.5 Distribution of OTU as a function of their prevalence

由圖5可知，只出現(xiàn)1次的OTU有5622個(gè)，占OTU總數(shù)的83.50%，其所包含的序列有19170條，占總序列數(shù)的9.43%；在5個(gè)樣品中均存在的OTU有64個(gè)，僅占OTU總數(shù)的0.90%，但其所包含的序列有127335條，占總序列數(shù)的62.67%，這說明5個(gè)臘魚樣本中含有大量共有細(xì)菌菌群。本研究將出現(xiàn)次數(shù)為5次且平均相對含量大于1.0%的OTU定義為核心優(yōu)勢OTU，其分析結(jié)果如圖6所示。

圖6 核心優(yōu)勢菌OTU含量分布Fig.6 The bar chart of core OTUs

由圖6可知，樣品中核心優(yōu)勢OTU及其平均相對含量分別為OTU230（19.65%）、OTU6669（18.27%）、OTU3491（5.84%）、OTU3919（3.06%）、OTU2016（1.71%）和 OTU285（1.59%），其中 OTU230、OTU3919、OTU2016和OTU285隸屬于Psychrobacter，OTU6669隸屬于Brochothrix，OTU3491隸屬于Staphylococcus，說明Psychrobacter、Brochothrix和Staphylococcus為恩施臘魚樣品中核心優(yōu)勢細(xì)菌屬。由圖6亦可知，LY1中OTU6669（Brochothrix）和LY3中OTU34919（Staphylococcus）的相對含量明顯高于其他樣品，而LY2和LY4中核心優(yōu)勢OTU的累積平均相對含量要低于LY1、LY3和LY5，說明核心優(yōu)勢OTU在各樣品中的相對含量存在差異。

3 結(jié)論

采用PCR-DGGE和MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法對恩施地區(qū)臘魚細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恩施地區(qū)臘魚中的優(yōu)勢細(xì)菌主要由隸屬于Proteobacteria的Psychrobacter及隸屬于Firmicutes的Brochothrix構(gòu)成，兩者的相對含量占到了細(xì)菌總數(shù)的55.44%。雖然不同臘魚樣品中含有較為獨(dú)特的細(xì)菌種群，但其含有62.67%的核心細(xì)菌類群，且核心細(xì)菌類群主隸屬于Psychrobacter、Brochothrix和Staphylococcus。通過本研究的開展，對恩施地區(qū)臘魚品質(zhì)的穩(wěn)定性和安全性的提升提供了一定數(shù)據(jù)支撐。