響應(yīng)面法優(yōu)化香水蓮花多酚的提取工藝及其抗氧化活性

周琦，曾瑩，祝遵凌,2,3

(1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇南京 210037)

（2.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院,江蘇南京 210037)(3.南京林業(yè)大學(xué)藝術(shù)設(shè)計學(xué)院,江蘇南京 210037)

香水蓮花(Nymphaea hybrid)，是一種睡蓮科睡蓮屬植物，分布于海南、廣州、福建、四川、浙江等地，屬于熱帶睡蓮。因其花色多變，香味奇特，故又稱之為“九品香蓮”[1]。香水蓮花可常年開花，花姿優(yōu)雅，花色豐富，花香宜人，可終年觀賞。同時，該屬植物具有多種藥效功能[2～4]，還能凈化和修復(fù)水體、土壤及大氣污染[5～7]。香水蓮花不僅是重要的新興園林水生觀賞植物，還是高檔的鮮切花，可盆栽、庭院造景，打造主題農(nóng)業(yè)觀光園和風(fēng)景區(qū)建設(shè)，亦可用于城市道路沿線水體景觀營建，兼具觀賞及美化環(huán)境的作用，具有很大的經(jīng)濟(jì)價值、生態(tài)價值和觀賞價值。

近年來，香水蓮花的食用性和保健作用受到越來越多人的關(guān)注。香水蓮花的鮮花可提取精油、純露[8]，花中含有豐富的植物性胎盤素，是一種天然的香料和化妝品添加劑[9]。香水蓮花亦可制成花茶，其花茶集茶味與花香于一體，濃郁爽口、氣味芬芳，同時也具有良好的藥理作用，花中的植物膠原蛋白可以美容護(hù)膚，促進(jìn)新陳代謝[10,11]。動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)香水蓮花具有調(diào)節(jié)脂類物質(zhì)代謝[12]，預(yù)防和治療疾病[13]等功效。香水蓮花含有豐富的多酚、黃酮類物質(zhì)[14]，具有很強(qiáng)的自由基清除能力和生物活性，其酚類物質(zhì)主要是黃酮類及酚酸類化合物，包括黃酮、黃酮醇和異黃酮類物質(zhì)[15]。酚類物質(zhì)作為天然的抗氧化劑和保鮮劑，可廣泛用于食品、日化和醫(yī)藥等領(lǐng)域[16,17]，具有很大的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值。目前，關(guān)于香水蓮花多酚提取方法的研究尚不多見，因此，本文通過探究香水蓮花多酚的提取工藝，及其體外抗氧化作用，以期為香水蓮花的多角度利用提供依據(jù)，同時為其資源的綜合開發(fā)提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 原料

香水蓮花，試驗(yàn)所選的黃色香水蓮花為福建漳州香水蓮花合作社提供。福林酚、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)，上海源葉生物科技有限公司；2,2'-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、沒食子酸，阿拉丁試劑公司；2,4,6-三吡啶三吖嗪(TPTZ)，上海麥克林生化科技有限公司；過硫酸鉀、碳酸鈉、抗壞血酸（Vc），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

FW-80高速粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BS124S電子天平，德國賽多利斯公司；Sigma 2-16PK臺式高速離心機(jī)，德國Sigma公司；Lambda 25型紫外可見分光光度計，美國Perkin Elmer公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHZ-III型循環(huán)水多用真空泵、RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香水蓮花多酚物質(zhì)提取

香水蓮花洗凈后置于烘箱中，60～65℃下烘24 h，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，避光密封保存?zhèn)溆?。稱取香水蓮花干花粉末，置于250 mL錐形瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計的液料比加入一定濃度的乙醇，在設(shè)定的時間和溫度下進(jìn)行浸提，然后將粗提液進(jìn)行減壓抽濾，用乙醇定容至100 mL，得到香水蓮花多酚提取液。

1.3.2 多酚含量測定

1.3.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

精確稱取100 mg 沒食子酸，用離子水配制成1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲液。準(zhǔn)確量取1.0～5.0 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲液至l00 mL的容量瓶中，用水定容，得到梯度質(zhì)量濃度（10、20、30、40、50 μg/mL）的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。量取梯度標(biāo)準(zhǔn)液各0.5 mL，依次加入2.0 mL 10%（體積比）的福林酚溶液，充分搖勻后再靜置5 min，然后再依次加入2 mL 7.5%的碳酸鈉稀釋液，室溫下放置反應(yīng)2 h。以純水代替試劑作為對照，測定波長為765 nm處的吸光值。以沒食子酸與吸光度的值繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時求出回歸方程：Y=0.0042X+0.0042，R2=0.9959；其中，Y為吸光度，X為沒食子酸濃度，μg/mL。

1.3.2.2 香水蓮花多酚提取率的測定

香水蓮花多酚的含量采用福林酚比色法（Folin-Ciocalteu）來測定[18,19]，并略作修改。精確吸取0.5 mL香水蓮花多酚提取液，加入2 mL 10%的福林酚試劑，充分搖勻后靜置5 min，再添加2 mL濃度為7.5%的碳酸鈉溶液，在室溫下放置，反應(yīng)時間為2 h，然后在765 nm處測吸光值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出多酚的含量。按下式計算多酚提取率：

注：C—香水蓮花提取液多酚濃度（μg/mL）；V—多酚提取液總體積（mL）；F—稀釋倍數(shù)；M—香水蓮花質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以香水蓮花多酚提取率為考察指標(biāo)，以浸提溫度為60 ℃，液料比為40:1（mL/g），浸提時間為1 h，乙醇濃度為 60%（V/V）為固定因子，分別考察浸提溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、液料比（20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1 mL/g）、浸提時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）和乙醇濃度（0%，20%，40%，60%，80%，100%）對多酚提取率的影響。

1.3.4 香水蓮花多酚提取工藝條件的優(yōu)化

依據(jù)Box-Behnken中心組合進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計[20,21]，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化香水蓮花多酚的提取工藝。在上文單因素水平的分析基礎(chǔ)之上，選取4個單因素為自變量，每個自變量分別以-1、0、1表示低、中、高三個試驗(yàn)水平，來進(jìn)行編碼。以香水蓮花多酚提取率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，見表1。

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計Table 1 Design for response surface methodology

1.3.5 香水蓮花多酚抗氧化能力的測定

1.3.5.1 清除DPPH自由基的能力

將最佳提取條件下的香水蓮花多酚提取液，經(jīng)濃縮、干燥后配制成不同質(zhì)量濃度的樣液。根據(jù)參考文獻(xiàn)[22]，取0.5 mL香水蓮花多酚樣品溶液，加入4.0 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH稀釋溶液，在室溫下?lián)u勻，避光靜置30 min后，在517 nm處測量吸光值，以Trolox和Vc作陽性對照。按下式計算DPPH·的清除率：

注：A0為DPPH加乙醇溶液的吸光度，A1為DPPH加樣品的吸光度，A2為樣品加乙醇溶液吸光度。

1.3.5.2 清除ABTS自由基能力

根據(jù)參考文獻(xiàn)[23]，以濃度為7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀混合溶液配制ABTS自由基的陽離子工作液。準(zhǔn)確吸取0.5 mL不同質(zhì)量濃度的香水蓮花多酚樣液與 3.9 mL工作液，混合后靜置，在23 ℃條件下反應(yīng)6 min，然后在734 nm波長處測量其吸光度，以蒸餾水作為空白對照，按公式（2）計算ABTS自由基清除率（%），以Trolox和Vc作陽性對照。

1.3.5.3 還原力測定-FRAP法

根據(jù)參考文獻(xiàn)[24]，準(zhǔn)確吸取0.5 mL不同濃度的香水蓮花多酚樣液，加入4.0 mL的TPTZ工作液，充分混勻后，在37 ℃條件下，靜置30 min，然后測定波長在593 nm處的吸光值，以吸光值表示還原力的大小，并以Trolox和Vc作陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 香水蓮花多酚提取工藝單因素試驗(yàn)研究

圖1 浸提溫度對香水蓮花的多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of polyphenols in Nymphaea hybrid

浸提溫度對香水蓮花多酚提取率的影響如圖1所示，由圖可知多酚提取率在較低溫度時，隨著浸提溫度的增大而不斷上升，當(dāng)溫度達(dá)到 60 ℃時，提取率達(dá)到最大值，為 6.79%。之后，隨溫度升高，多酚提取率反而逐漸變小，可能是因高溫對多酚造成破壞，引起提取率下降。因此，選擇60 ℃為最佳水平。

圖2 液料比對香水蓮花的多酚提取率的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the yield of polyphenols in Nymphaea hybrid

圖 2顯示了液料比對香水蓮花多酚提取率的影響。由圖可看出，液料比的大小對多酚的提取率產(chǎn)生了一定的影響，總體隨比值的增大，呈先增后降的趨勢，提取率在液料比為50:1 mL/g時，達(dá)到一個峰值，為6.84%，而后，提取率又開始逐漸變小，可能是因?yàn)槠渌既苄缘奈镔|(zhì)溶出，引起多酚提取率的下降。所以，選擇液料比為50:1 mL/g較為合適。

圖3 浸提時間對香水蓮花末多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polyphenols in Nymphaea hybrid

圖4 乙醇濃度對香水蓮花末多酚提取率的影響Fig.4 Effect of alcohol concentration on the yield of polyphenols in Nymphaea hybrid

浸提時間對多酚的提取率也有重要的影響。如圖3所示，在浸提溫度60 ℃條件下，隨浸提時間的增加，香水蓮花多酚提取率在2 h 以內(nèi)逐漸增大，在2 h時，達(dá)最大值為6.96%。當(dāng)浸提時間繼續(xù)延長時，在氧氣、光照的影響下，酚類物質(zhì)可能被氧化分解，使得多酚提取率不再增加，甚至開始下降，但趨勢不明顯。因而，選擇2 h作為最佳浸提時間。

乙醇對酚類物質(zhì)具有較好的溶解性，且較為經(jīng)濟(jì)，無毒。因此，本研究選擇乙醇作為提取劑。由圖4可知，在溫度為60 ℃，液料比為40:1，浸提時間為1 h的條件下，香水蓮花多酚提取率隨乙醇濃度的增大而逐漸增高，當(dāng)乙醇濃度為60%時出現(xiàn)峰值，提取率達(dá)到 6.69%；而當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大時，提取率反而逐漸變小?？赡苁且?yàn)?0%濃度的乙醇溶液與香水蓮花酚類物質(zhì)的極性較為接近，此濃度作為提取劑較為合適。

2.2 香水蓮花多酚提取工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

以香水蓮花多酚提取率為考察響應(yīng)值，浸提溫度（A）、液料比（B）、浸提時間（C）、乙醇濃度（D）4因素為考察自變量，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析結(jié)果（表2）。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化香水蓮花多酚提取的結(jié)果分析Table 2 Experimental design and results of optimizing test with response surface method of polyphenols in Nymphaea hybrid

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17 70 60 2 60 5.88 6.03 18 70 40 2 60 7.90 7.45 19 50 40 2 60 7.45 7.25 20 60 60 2 40 6.33 6.44 21 60 50 2.5 80 5.60 5.42 22 60 50 1.5 80 6.88 6.68 23 60 40 2.5 60 6.90 7.11 24 60 50 2.5 40 6.26 6.41 25 50 50 2 40 7.76 7.30 26 50 50 2 80 6.49 6.19 27 70 50 2.5 60 6.11 6.13 28 60 50 2 60 8.21 8.11 29 50 50 1.5 60 7.33 7.53

表3 回歸模型結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

2.2.2 模型建立及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

使用Design-Expert8.0 軟件對表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到香水蓮花提取率（Y）對4因素的回歸方程：

在該方程中，不同因素的系數(shù)對應(yīng)的絕對值大小，可以直接表示不同因素對提取率（Y，即響應(yīng)值）所產(chǎn)生影響的程度，而系數(shù)的正、負(fù)則表示產(chǎn)生影響的方向[25]。

回歸模型方差分析結(jié)果見表 3，模型的 F值為8.97，其概率 P=0.0001，達(dá)到極顯著水平，說明該模型具有顯著性；同時，失擬項(xiàng)P值不顯著，表示模型擬合較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.9697，R2Adj=0.9423，說明預(yù)測值與實(shí)際值相關(guān)性較好，該模型可以用于香水蓮花多酚提取率的理論預(yù)測。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示A、B、C、D 對香水蓮花多酚提取率表現(xiàn)出顯著性影響，各交互項(xiàng)對多酚提取率影響不顯著，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對多酚提取率有極顯著性影響，表明浸提溫度、液料比、浸提時間、乙醇濃度是多酚提取過程中重要的影響因素；根據(jù)方差分析結(jié)果可知，各因素對香水蓮花多酚提取率的影響依次為：C、D、B、A。

響應(yīng)面法可以優(yōu)化多因素條件下的最佳方法。從3d曲面圖和等高線圖能夠看出，在最佳條件下不同變量的取值和各變量之間產(chǎn)生交互作用的顯著程度[26]。由所求出的回歸方程，可以繪制響應(yīng)面圖，如圖5a～5f所示，圖中直觀地反映了浸提溫度（A）、液料比（B）、浸提時間（C）、乙醇濃度（D）對香水蓮花多酚提取率的影響。

圖5 不同因素交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour and response surface plots for the correlative effects of different factors

圖 5a等高線顯示，浸提時間和乙醇濃度處于 0水平時，浸提溫度和液料比之間的交互作用并不強(qiáng)，當(dāng)固定溫度時，隨著液料比的增加，多酚提取量也不斷增大，但達(dá)到峰值后又逐漸變小；響應(yīng)面圖顯示，多酚提取率在浸提溫度的-1～0水平和液料比的-1～0水平之間有最大值。圖5b顯示，液料比和乙醇濃度為0水平時，浸提溫度與時間的交互作用也較弱，其中浸提溫度的影響強(qiáng)度相對低于浸提時間，多酚提取率在浸提時間-1～0水平之間有最大值。由圖5c可知，液料比和浸提時間處于0水平，當(dāng)固定乙醇濃度時，多酚的提取率隨溫度的增大而提高，當(dāng)固定溫度時，多酚的提取率乙醇濃度的變化呈類似趨勢，但后者的變化幅度較前者大，這也與前文單因素的分析結(jié)果相對應(yīng)。圖5d顯示，溫度和乙醇濃度處于0水平，液料比和時間的交互作用。在較低因子水平下，隨液料比和時間的增大，提取率不斷變大，達(dá)到極值后，反而變小。從圖 5e可以看出，當(dāng)浸提溫度和時間處于 0水平時，乙醇濃度對多酚提取率的影響相對較大，多酚提取量在乙醇濃度-1～0水平之間有最大值。圖5F顯示，浸提溫度和液料比處于0水平，當(dāng)固定乙醇濃度時，多酚提取量隨時間的增加先增大后降低；同樣，當(dāng)固定時間時，多酚的提取率隨乙醇濃度的變化也呈相似趨勢。通過響應(yīng)面分析軟件 Design Expert 8.0.6對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得香水蓮花多酚提取最佳工藝為：浸提溫度58.20 ℃，液料比48.06:1 mL/g，浸提時間1.87 h，乙醇濃度56.87%，預(yù)測香水蓮花多酚提取率可達(dá)8.25%。實(shí)際操作中，將最優(yōu)條件調(diào)整為：浸提溫度58 ℃，液料比48:1 mL/g，浸提時間1.9 h，乙醇濃度57%，按此工藝進(jìn)行提取驗(yàn)證，得香水蓮花多酚提取率平均值為8.28%，與預(yù)測值接近，說明該模型能夠較好地預(yù)測香水蓮花多酚實(shí)際提取率。

2.3 香水蓮花抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH自由基的能力

圖6 香水蓮花多酚對DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical-scavenging activities of polyphenols in Nymphaea hybrid

在最佳條件下得到香水蓮花多酚提取液，經(jīng)濃縮干燥后配制成不同濃度的樣液，用以進(jìn)一步研究香水蓮花多酚的抗氧化能力，結(jié)果如圖6所示。香水蓮花多酚對DPPH自由基的清除能力隨多酚質(zhì)量濃度的升高而增大，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為12 μg/mL時，清除率達(dá)90.22%，總體變化趨勢與Trolox和Vc相似。說明，香水蓮花多酚對DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)。

2.3.2 清除ABTS自由基能力

圖7 香水蓮花多酚對ABTS自由基的清除作用Fig.7 ABTS radical-scavenging activities of polyphenols in Nymphaea hybrid

香水蓮花多酚物質(zhì)對ABTS自由基的清除作用如圖7所示。由圖7可知，香水蓮花多酚能有效清除試驗(yàn)體系中的 ABTS自由基，且不同濃度多酚樣液對ABTS自由基的清除效果存在差異。受試質(zhì)量濃度由2～12 μg/mL，提取物對 ABTS自由基的清除率從20.54%增加到88.01%，略低于Trolox和Vc對ABTS自由基的清除能力。

2.3.3 還原力的測定

圖8 香水蓮花多酚還原能力Fig.8 Reducing power of polyphenols in Nymphaea hybrid

抗氧化性與還原性之間存在正相關(guān)性，通常還原性越強(qiáng)，則抗氧化性越強(qiáng)。香水蓮花多酚還原能力如圖8所示。由圖可知，隨著香水蓮花多酚質(zhì)量濃度的升高，593 nm處吸光值值不斷增大，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為12 μg/mL時，還原力達(dá)到最大，比濃度為2 μg/mL時高出56.7%，表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明香水蓮花多酚具有較強(qiáng)的還原能力，但低于 Vc，和Trolox的還原力相差不大。

3 結(jié)論

本文通過考察浸提溫度、液料比、浸提時間、乙醇濃度對香水蓮花多酚提取率的影響，利用響應(yīng)面法分析獲得提取香水蓮花多酚的最佳組合為：浸提溫度58 ℃，液料比48:1 mL，浸提時間1.9 h，乙醇濃度57%，在此條件下香水蓮花多酚提取率可達(dá)8.28%。不同提取條件對多酚提取率的影響由大到小為：浸提時間＞乙醇濃度＞料液比＞浸提溫度。通過測定香水蓮花不同濃度多酚樣液對 DPPH、ABTS的清除能力和還原能力的大小，評價了其多酚的抗氧化活性，香水蓮花多酚對DPPH自由基清除率可達(dá)90.22%，ABTS自由基清除率達(dá)88.01%，F(xiàn)RAP還原力隨多酚濃度的升高而增大，表明香水蓮花多酚具有一定的抗氧化能力。