東海中華管鞭蝦多酚氧化酶（PPO）的純化及特性研究

呂敏，黃光華，楊慧贊，王瑞，馬華威，甘暉，曾蘭，相興偉

（1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西南寧 530021）（2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316000）（3.廣西水產(chǎn)畜牧學校，水產(chǎn)養(yǎng)殖研究室，廣西南寧 530021）

關鍵字：中華管鞭蝦；多酚氧化酶(PPO)；酶學性質；純化

蝦類在儲藏和運輸過程中，其體內多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)誘導的黑變大大降低了蝦的品質和市場價值，造成巨大損失[1]。因此，我們需要獲取的高純度的PPO，并對其特性進行研究，為了有效地控制中華管鞭蝦在運輸和儲藏過程的黑變提供參考。黑變發(fā)生主要是PPO誘導酚類化合物生成醌，醌非酶聚合促進高分子不溶性黑色素沉淀，造成蝦黑變[2]。研究發(fā)現(xiàn)，由于蝦體內的酚類化合物含量高以及純化過程中這些酚類物質易于與 PPO形成不可逆結合，給從蝦類獲得高純均一的PPO帶來了困難[3]。目前，國內外研究了挪威龍蝦(Nephrops norvegicus)、日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)、佛羅里達龍蝦(Panulirus argus)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的PPO純化技術和酶特性[4,5]，比如Zotos和Taylorp等研究了挪威龍蝦 PPO的部分提純工藝和在黑變激活機制中的作用[6]；Encarnacion等[7]發(fā)現(xiàn)蘑菇提取活性物對日本對蝦黑變具有抑制作用；Manheem等[8]報道稱，不同冷藏條件下凡納濱對蝦PPO變化不同，溫度與PPO活性呈反比，溫度越低其活性較弱；Ali等[9]報道了佛羅里達龍蝦黑變的PPO提純和激活機制，Nirmal等[10]研究了凡納濱對蝦 PPO純化手段和生物學特性。

國內初步研究了中華管鞭蝦(Solenocera crassicornis) PPO的提純手段和部分生物特性，主要勻漿浸、硫酸銨無分級沉淀提純，并調查了該PPO在各組織分布、選取部分底物研究酶特性，以及篩選抑制劑[11～15]，國外未見相關報道。未高度純化的中華管鞭蝦PPO，限制了對其酶特性的深入研究，因而，我們需要選擇合適的純化技術和步驟對中華管鞭蝦PPO進行高度純化，再對其酶特性進行研究。本文主要采用硫酸銨分級沉淀、DEAE離子、苯基瓊脂糖凝膠過濾純化從中華管鞭蝦體內提取的PPO，對其動力學特征進行探討，并選取不同抑制劑和金屬離子為底物研究該PPO特性，為尋找廉價、安全、有效、新型的中華管鞭蝦黑變抑制物質提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

中華管鞭蝦于2015年10月捕撈于浙江舟山市普陀區(qū)沈家門港近岸東海海域(東經(jīng) 121.39°，北緯29.51°)，平均體長9.0±0.9 cm和體重18.5±3.5 g，冰塊冷凍送至實驗室后去除頭胸部，冷水沖洗后液氮冷凍，攪切器粉碎成粉末，真空包裝-60 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

Tris-HCl緩沖液、丙酮、乙二胺四乙酸(EDTA)、L-3-(3,4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸(L-DOPA)、考馬斯亮藍 R250、硫酸銨、苯硫脲、半胱氨酸(Cys)、檸檬酸、抗壞血酸，購買于國藥集團化學試劑有限公司；4-甲基鄰苯二酚、兒茶酚、苯酚、苯二酚，購買于北京索萊寶科技有限公司；5-Triton X-100、苯基-瓊脂糖凝膠CL4B、DEAE CI-16B、瓊脂糖6B，購買于南京建成生物工程；其它均為分析純。

1.3 儀器與設備

CR21G冷凍離心機，購買于日本日立；立式壓力滅菌器、Waring攪切器，購買于國華電器有限公司；TSK凝膠 SW3000色譜柱、DEAE-16B色譜柱、UV-2102C型紫外可見分光光度計，購買與上海生物工程有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 勻漿浸提法提取PPO

PPO提取按照鄭斌等[11]人的方法，并略作修改。稱取備用蝦粉末樣品100 g，設置料液比1:2 (W/V)，緩沖液pH 7.5，浸提4 h，水浴溫度50 ℃，添加40 mL pH 7.5 的 Tris-HCl溶液，4 ℃下研磨后，靜置 4 h，4 ℃環(huán)境下1000 g冷凍離心30 min，取上清液作粗酶液，并根據(jù)Bibhuti等[17]人方法計算PPO活性、蛋白質含量、回收率、酶比活和純化倍數(shù)。

以4-甲基鄰苯二酚為底物，添加0.88 mL 磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，0.05 mM)、0.1 mL底物(0.1 M)和0.02 mL酶提取液，制備成混合液，在420 nm 每隔30 s記錄一次，共記錄 3 min，計算每分鐘平均吸光值，酶活單位就是引起每分鐘吸收變化 0.1的酶量，PPO活力以Units/ml表示，產(chǎn)量以體積比（%）表示，酶比活以Units/(mg protein)表示，為方便計算每一步純化后的酶產(chǎn)量，中華管鞭蝦 PPO的總酶活被認為100%。

1.4.2 純化

硫酸銨分級沉淀按照楊會成等[12]人方法并略作修改。粗酶液置于7個小燒杯于4 ℃冰箱內磁力攪拌，5～10 min內分別加入10%、20%、30%、40%、50%、60%和70%研磨好的硫酸銨，再攪拌30 min，冷凍離心機4 ℃環(huán)境下10000 g離心30 min，收集沉淀，用pH 7.5 Tris-HCl緩沖液溶解。在4 ℃用Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，0.05 mM)透析去除多余的硫酸銨。各樣品分別取2 mL，測定各分級沉淀樣品的酶活性和蛋白質含量。將活性較高質量分數(shù)片段范圍的PPO混合后，冷凍干燥后-60 ℃保存。

DEAE離子交換層析前，首先將250 mL蒸餾水沖洗DEAE CI-16B瓊脂糖柱材料(40 mL)，然后硫酸鹽緩沖液(pH 7.5，2 mM)沖洗。超純水稀釋硫酸銨純化品至700 mL (pH調至7.5)，與DEAE柱材料混合。在4 ℃保持慢速攪拌30 min，然后500 mL磷酸緩沖液(pH 7.5，2 mM) 沖洗2次后過柱，用梯度NaCl液(0～0.5 M，NaCl溶于pH 為7.5的2 mM硫酸鹽緩沖液制備而成)進行梯度洗脫，別分收集后，透析除鹽，測定各梯度洗脫樣品的酶活力和蛋白質含量。合并酶活較好的部份，冷凍干燥，-60 ℃保存。

苯基瓊脂糖凝膠疏水層析前，預先用50 mL蒸餾水以洗脫平衡苯基瓊脂糖填柱料(10 mL)，然后 500 mL磷酸緩沖液(pH 7.5，2 mM)沖洗。取多酚氧化酶純化品，超純水將其稀釋至15 mL，用25 mL 18%硫酸銨飽和(硫酸銨溶解于20 mM硫酸鹽緩沖液中)，然后注射器8 Mpa緩慢勻速注入，50 mL磷酸鹽(pH 7.5，2 mM)洗脫液按含18%～0%硫酸銨梯度順序洗脫，收集洗脫樣品。分別收集洗脫樣品，透析除鹽，測定洗脫樣品的酶活力和蛋白質含量，合并酶比活較好的PPO純化品，冷凍干燥后-60 ℃保存。

計算PPO活性、蛋白質含量、回收率、酶比活和純化倍數(shù)，以粗酶液的酶比活為基準，每一步純化后PPO增加的倍數(shù)被認為是純化倍數(shù)。

1.4.3 底物專一性分析

按照吳亮亮等[16]人方法并略作修改。配制濃度為0.01 M的L-DOPA、兒茶酚、對苯二酚和苯酚。取1 mL酶液分別與2.5 mL的L-DOPA、兒茶酚、對苯二酚和苯酚混合后，再加入3 mL的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，在50 ℃水浴加熱10 min，在490 nm處測定其吸光值，繪制曲線。

1.4.4 以L-DOPA為底物的PPO動力學特性

以L-DOPA為底物，分別設置濃度為 0.01、0.05、0.10、0.15、0.2、0.3和0.4 M。取1 mL底物液與1 mL高效液相純化酶液混合，45 ℃水浴10 min，490 nm處測定吸收值，計算酶活力，用 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法繪制出PPO動力學曲線。

1.4.5 不同抑制劑和金屬離子對 PPO活性的影響

將檸檬酸、抗壞血酸、苯硫脲、Cys、EDTA、CaCl2、MgSO4、CuSO4和 ZnCl2分別溶于 2 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，各抑制劑均配成12個梯度樣品液，即0.01、0.015、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1和0.2 M。

各取1 mL的抑制劑梯度液，分別加入1 mL高效液相純化酶液，在4 ℃冰箱中抑制0.5 h，隨后添加2.5 mL底物L-DOPA液、3 mL Tris-HCl緩沖液，在50 ℃下水浴10 min，加3 mL蒸餾水，終止反應。在490 nm處測定吸光值，陽性對照以1 mL的蒸餾水為參照，選取不同抑制劑和金屬離子的最佳濃度所對應的酶活力數(shù)值作圖。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel和Origin 7.0軟件進行統(tǒng)計分析,結果以平均值±標準差(±sd)表示。

2 結果

2.1 純化

圖1 中華管鞭蝦PPO純化Fig.1 The profiles of PPO from Solenocera crassicornis

本實驗采用勻漿浸提法從中華管鞭蝦體內提取PPO的活力可達86.79 Units/(mg protein)。經(jīng)硫酸銨分級沉淀、DEAE離子交換、苯基瓊脂糖凝過濾純化如圖 1 (a)～(c)所示。

圖1(a)表示粗PPO經(jīng)硫酸銨質量分數(shù)10%～70%分級沉淀后的活性，結果顯示，中華管鞭蝦粗PPO的酶活集中在硫酸銨質量分數(shù)40%～60%，且顯著高于其它質量分數(shù)，因此，收集該質量分數(shù)的PPO用于DEAE離子交換純化。

圖1(b)為經(jīng)DEAE離子交換的PPO活性和蛋白含量，結果表明，PPO在pH 7.5條件下與DEAE色譜柱結合，0～0.5 mol/L鹽濃度梯度洗脫后，洗脫峰出現(xiàn)在30～62號管且42號管為活性最高峰值，而在此范圍，蛋白質含量不斷增加，在42號管中出現(xiàn)最高峰值，隨后下降。因而，收集PPO的活性較高的30～62號管中的PPO進行下一步純化。

圖1(c)表示經(jīng)苯基瓊脂糖凝膠過濾的PPO活性和蛋白含量。PPO洗脫峰出現(xiàn)在24～36號管且30號管的活性最高，蛋白質洗脫峰位于38～40號管。因此，收集活性較高的28～36號管，以用于下一步測試。

2.2 純化結果分析

中華管鞭蝦 PPO經(jīng)過純化后的結果所示如圖 2(a-g)。結果表明，PPO的液體體積、蛋白含量和總酶活不斷減少，而酶比活不斷增加，回收率與純化倍數(shù)之間呈負相關。硫酸銨分級沉淀、DEAE離子交換色譜層析、苯基瓊脂糖凝膠過濾后的體積、產(chǎn)量、純化倍數(shù)結果如表1，PPO的最終獲得體積為3.7 mL，純化倍數(shù)為25.9，而產(chǎn)量僅為1.2%。主要是由于每個純化步驟后有目的的收集峰值區(qū)域的 PPO用于下一步的純化，導致酶比活和純化倍數(shù)增加，總酶活、體積、產(chǎn)量減少。

表1 純化后的中華管鞭蝦PPO純化結果Table 1 The results of purified PPO from Solenocera crassicornis

2.3 底物專一性分析及動力學特征

以不同濃度的L-DOPA、兒茶酚、對苯二酚、苯酚為底物，研究部分純化后PPO的底物專一性，結果如圖3所示。PPO催化L-DOPA和兒茶酚催化作用較強，對苯酚和對苯二酚作用較小，因而本實驗選取L-DOPA和兒茶酚作為PPO的特異性底物研究動力學特性。如圖4(a)和圖4(b)分別表示以L-DOPA和為底物的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖所示，L-DOPA的Km值最低，為3.8 mM，兒茶酚8.12 mM。

圖3 純化后的中華管鞭蝦PPO底物的專一性Fig.3 The substrate specificity of purified PPO from Solenocera crassicornis

圖4 部分純化后的中華管鞭蝦PPO的動力學特性Fig.4 The kinetic properties and profiles of partially purified PPO from Solenocera crassicornis

圖5 不同抑制劑和金屬離子對部分純化后的中華管鞭蝦PPO活性的影響Fig.5 Effects of different inhibitors and some metal ions on the oxidizing activity of the purified PPO from Solenocera crassicornis

3 結論

3.1 勻漿浸提法能夠使原料充分勻漿，增大蝦體內PPO與浸提液的接觸面，提高提取率[12]。浸提過程中，浸提時間的過久能使PPO與底物反應生成中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物的聚合可導致酶的沉淀和活力降低,降低了PPO的活性[9,14]。在本研究中中華管鞭蝦PPO (4 h)酶比活可達86.79 Units/(mg protein)，略高于楊會成等人提取的PPO(3 h)，主要差異原因可能是本實驗浸提時間較長。

3.2 生物體內豐富的酚化合物與 PPO結合生成不可逆結合，影響該酶的離子和疏水特性，干擾洗脫，給高度純化過程帶來了難度[7]。硫酸銨分級沉淀是純化PPO的常用方法之一，楊會成等[12]人采用 10%～60%硫酸銨質量分數(shù)片段沉淀獲取中華管鞭蝦PPO，發(fā)現(xiàn)40%～50%質量分數(shù)范圍活性較強，本研究采用硫酸銨質量分數(shù)片段為 20%～70%，40%～60%范圍活性均較強，最佳硫酸銨飽和度為50%，可能中等質量分數(shù)更能誘導中華管鞭蝦 PPO的構象變化而導致沉淀。另外，人們發(fā)現(xiàn)硫酸銨提純蝦PPO時，最佳質量分數(shù)片段位于低質量片段范圍，比如凡納濱對蝦(40%)[9]、日本對蝦(30%～40%)[13]，表明不同蝦類提取PPO時，所采用的硫酸銨飽和度也不相同，進一步證實了沉淀PPO的硫酸銨飽和度依賴于種類[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，除硫酸銨質量分數(shù)40%～60%以外，中華管鞭蝦PPO在其他質量分數(shù)片段活性低，可能由于該PPO與酚類化合物的結合生成了非專一性沉淀的結果。經(jīng)過DEAE離子交換色譜層析、苯基瓊脂糖凝膠過濾純化后，PPO的最終產(chǎn)量卻僅占1.2%，而純化倍數(shù)為25.9，高于凡納濱對蝦(2.4倍)[1]、日本對蝦(19.4倍)[7]，可能由于不同種類蝦體內含有不同種類和數(shù)量的酚類物，以及其與PPO產(chǎn)生不可逆結合程度存在差異，不同程度的干擾PPO純化所致[16]，也可能與純化技術、操作過程相關。

3.3 本研究發(fā)現(xiàn)，中華管鞭蝦PPO對兒茶酚、L-DOPA具有較大催化活力，對 L-DOPA(Km為 3.8 mM 和R=0.982)、兒茶酚(Km為8.12 mM和R=0.991)具有高度相關性和較高親和力，而對對苯二酚、苯酚氧化作用極低，推斷其可能屬于兒茶酚酶家族(EC 1.10.3.1)。此外，中華管鞭蝦PPO對L-DOPA的Km值大大高于白對蝦(2.8 mM)[2]、挪威龍蝦(1.6 mM)[4]、美國龍蝦(2.13 mM)[5]、凡納濱對蝦(0.81 mM和3.48 mM)[10,18]、黑虎對蝦(4.45 mM)[3]以及日本蟳(3.41 mM)[17]，可能蝦蟹類PPO的Km值大小與種類及其生境相關。

3.4 本研究發(fā)現(xiàn)，苯硫脲、抗壞血酸、Cys、Zn2+、Cu2+、檸檬酸、EDTA能抑制PPO活性，檸檬酸、苯硫脲、EDTA抑制最強，而Ca2+和Mg2+能增強其活性[18]。EDTA是一種專一性二價金屬離子螯合劑，與PPO結合能抑制蝦黑變[14]。EDTA對該PPO具有顯著抑制作用，推斷該中華管鞭蝦PPO可能是一種金屬酶。苯硫脲是Cu2+螯合劑，檸檬酸通過降低pH和螯合PPO活性區(qū)域的Cu2+而起到抑制作用[19]。苯硫脲能夠通過螯合日本對蝦體內的 PPO金屬酶活中心的 Cu2+促使酶活喪失[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，中華管鞭蝦PPO對苯硫脲和檸檬酸較敏感，進一步表明該酶可能是一種活性部位含Cu2+的金屬酶。本研究結果與日本對蝦[13]、凡納濱對蝦[9]、龍蝦[5]的報道的結果相一致，表明中華管鞭蝦 PPO屬于含有Cu2+的兒茶酚氧化金屬酶。另外，Ca2+和Mg2+對PPO無任何抑制作用，反而增加了PPO的酶活力，與鄭斌等[11]人研究符合，可能是 Ca2+和Mg2+作為中華管鞭蝦 PPO的金屬激活劑起著激活作用。本實驗為控制中華管鞭蝦PPO黑變提供有價值的基礎數(shù)據(jù)。

3.5 本實驗純化了中華管鞭蝦PPO，研究其動力學特征和PPO特性。研究發(fā)現(xiàn)，4 h提取時間的酶比活可達86.79 Units/(mg protein)，PPO的最終產(chǎn)量卻僅占1.2%，而純化倍數(shù)為25.9，以對苯二酚、苯酚、兒茶酚、L-DOPA為底物時，對兒茶酚、L-DOPA具有較大催化活力，對對苯二酚、苯酚氧化作用極低，檸檬酸、苯硫脲、EDTA抑制PPO活性最強，通過結果推斷該PPO屬于含有Cu2+的兒茶酚氧化金屬酶家族。本研究能為控制中華管鞭蝦 PPO黑變提供有價值的基礎數(shù)據(jù)，為尋找廉價、安全、有效、新型的中華管鞭蝦黑變抑制物質提供參考。