野艾蒿提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用

毛跟年，胡家歡，劉藝秀

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021）

野艾蒿，拉丁名是 Artemisia lavandulaefolia，別名：蔭地蒿，野艾，小葉艾、狹葉艾，艾葉，苦艾，陳艾，多年生的草本植物。野艾蒿具有理氣行血，逐寒調經，安胎，祛風除濕，消腫止血等功能。能治感冒，頭痛，瘧疾，皮膚瘙癢，癰腫，跌打損傷，外傷出血等癥。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，有“嗜肉菌”的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染。美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。在醫(yī)院里，耐甲氧西林和其他抗生素的金黃色葡萄球菌廣泛流行，對萬古霉素不敏感的菌株也有所增加，給臨床治療帶來了很大的困難。從單味中藥或復方制劑抑菌作用研究來看，相對于抗生素的抗菌作用顯著，但其毒副作用、所引起的二重感染及細菌的耐藥等問題，其具有不易產生耐藥的特點與優(yōu)勢。目前對于野艾蒿研究比較多的是野艾蒿對其他物質的作用[1]，野艾蒿的化學組成[2,3]，野艾蒿黃酮的作用和揮發(fā)油的生物活性[4,5]。對于野艾蒿抗菌作用的研究，目前還處于初步階段。大部分的文獻報道，都只對野艾蒿粗提物進行體外抗菌活性實驗[6,7]，說明其具有抑菌活性。本文對野艾蒿粗提物做了初步的分離，研究了不同組分的體外抑菌活性，并且以體外抑菌最好的組分進行了體內抑菌活性的研究，為野艾蒿藥用功能的進一步開發(fā)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野艾蒿(Artemisia lavandulaefolia)，購買于河南洛陽。

酵母浸粉（生產批號：20180110），北京奧博星生物技術有限公司；蛋白胨（生產批號：20171016），北京奧博星生物技術有限公司；瓊脂粉（生產批號：20170920），北京奧博星生物技術有限公司；氯化鈉（生產批號：20170311），天津市天力化學試劑有限公司；硫酸鏈霉素（生產批號：S28D8Y51565），上海源葉生物科技有限公司；青霉素（生產批號：S28D8Y51565），上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器

KH5200DE超聲清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE52CS旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UV5100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；SW-CJ-1D超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHP-9082B恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司；滅菌鍋，上海博訊儀器有限公司等。

1.3 菌種與動物

菌種：金黃色葡萄球菌ATCC6538由陜西科技大學微生物實驗室提供。

動物：昆明小鼠，體重為18～22 g，全部為雄性，SPF級，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。許可證號：SCXK（陜）2018-001。

1.4 方法

1.4.1 野艾蒿的提取

1.4.1.1 提取方法

本實驗采用超聲輔助提取法對野艾蒿進行提取[8]。所選溶劑為95%乙醇。具體操作步驟為取50 g粉碎好的野艾蒿于1000 mL的錐形瓶種加入相應體積的溶劑，重復提取3次，合并濾液于旋轉蒸發(fā)器中濃縮到一定體積，再在水浴鍋上蒸干溶劑，最后在烘箱中放置過夜，得到野艾蒿粗提物干膏，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。得到的干膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取[2,9]，得到的萃取組分用同樣的方法得到干膏。

1.4.1.2 野艾蒿揮發(fā)油的提取[10]

采用水蒸氣蒸餾法提取。稱取100 g粉碎好的野艾蒿，加入1200 mL水，浸泡2.50 h，提取6 h。

1.4.2 各組分的抑菌圈測定

1.4.2.1 菌種的活化及菌懸液的配制[11]

菌種的活化：將細菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，121 r/min搖床培養(yǎng)20 h后，接種在平板上放入冰箱中備用。

菌懸液的配制：挑取活化后的金黃色葡萄球菌于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后取出，在超凈工作臺中，移液槍吸取0.50 mL的培養(yǎng)液于10 mL的無菌離心管中，加入1 mL的培養(yǎng)基備用。將稀釋好的培養(yǎng)液，在600 nm處以培養(yǎng)基為空白溶液測其吸光度，并用培養(yǎng)基調整使其吸光度與0.5麥氏比濁液在600 nm處的吸光值相同，再用新鮮滅菌的LB液體培養(yǎng)基將上述菌液按1:10稀釋后備用(含菌量約為1.5×107CFU/mL)。

1.4.2.2 自制濾紙片及藥敏片

自制濾紙片：將化學分析濾紙用打孔器制成6 mm的紙片，放入帶蓋子的瓶中，121 ℃高溫滅菌20 min即得。

自制藥敏片：除正丁醇組分用水飽和的正丁醇溶解外，其他的萃取組分均用各自的萃取劑溶解，配成40 mg/mL的溶液，并用0.22 μm的微孔濾膜過濾。吸取過濾后的溶液 5 μL于自制濾紙片上，在烘箱中65 ℃除去溶劑后，在吸取5 μL于相應紙片上并除去溶劑，共重復3次。得到的干藥敏片在紫外燈下殺菌后使用。

1.4.2.3 抑菌圈的測定

各萃取組分抑菌圈的測定：向滅菌的培養(yǎng)皿加入15～20 mL的LB固體培養(yǎng)基。待凝固后，用棉簽蘸取適量的菌懸液均勻涂布在培養(yǎng)皿中，貼上自制的藥敏片，以鏈霉素和青霉素作為陽性對照（鏈霉素和青霉素用無菌水配成1和0.5 mg/mL的溶液，采用1.4.2.2的方法只吸取一次藥液在室溫下晾干做成干濾紙片）。在37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，用直尺測量每種組分的抑菌圈大小。每組實驗重復3次取平均值。

揮發(fā)油抑菌圈的測定：用無水乙醇將揮發(fā)油配成40 mg/mL的溶液，以無水乙醇作為陰性對照，自制鏈霉素素干藥敏片做陽性對照。配好的溶液均采用0.22 μm的微孔濾膜過濾。將自制的濾紙片浸入相應的溶液中，使其充分吸收。在將含藥的紙片貼在涂有金黃色葡萄球菌的平板上，每組做三個平行。培養(yǎng)24 h后用直尺測量抑菌圈直徑，取三組的平均值。

1.4.2.4 抑菌指標判定[12]

高度敏感-抑菌圈直徑D≥20 mm，用“+++”表示；中度敏感-抑菌圈直徑15≤D＜20 mm，用“++”表示；低度敏感-抑菌圈直徑8≤D＜15 mm，用“+”表示；不敏感-抑菌圈直徑 D＜8 mm，用“-”表示。

1.4.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定[13,14]

采用二倍稀釋法測定各成分的最小抑菌濃度。將40 mg/mL的各組分溶液采用二倍稀釋法配成40、20、10、5、2.50、1.25、0.63、0.31 mg/mL的溶液。除揮發(fā)油外，都采用1.4.2.2的方法制成相應的干藥敏片。用2.2.3的方法測定各組分不同濃度下的抑菌圈。每個濃度的實驗做3組平行試驗。不出現(xiàn)抑菌圈的最小濃度為最低抑菌濃度。

1.4.4 對金黃色葡萄球菌生長曲線抑制作用的測定[15,16]

將培養(yǎng)至對數(shù)期的金黃色葡萄球菌按 2%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，加入野艾蒿組分，使其濃度達到最小抑菌濃度，37 ℃ 120 r/min搖床培養(yǎng)，在 0，2，4，6，8，10，12，22，26，30 h 取樣，對照組不加入野艾蒿提取物，各組以不加入菌液的液體作為調零組。用紫外分光光度計測定在波長為600 nm處測吸光度A，每組實驗重復3次取平均值，以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制金黃色葡萄球菌的生長曲線。

1.4.5 體內抑菌實驗[17,18]

由體外抑菌實驗可知乙酸乙酯相對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好，因此以乙酸乙酯相進行體內抑菌實驗的研究。

1.4.5.1 體內抑菌實驗預實驗

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌用生理鹽水配制成 30×108，30×107，30×106，30×105，30×104，30×103CFU/mL的菌懸液，按0.5 mL每20 g的劑量將不同濃度的菌懸液注入到小鼠腹腔內，每組10只小鼠，觀察4 d內小鼠的死亡情況，以小鼠死亡率80%以上作為實驗所用的感染小鼠的細菌濃度。

1.4.5.2 體內抑菌實驗

取小鼠60只，雌雄各半，隨機分為空白組、模型組、野艾蒿萃取物高低中濃度組（0.2，0.5，1 g/kg）、青霉素陽性對照組（0.17 g/kg）每組10只，空白組、模型組灌入等體積20%的吐溫80，野艾蒿萃取物不同濃度組按相應的量連續(xù)灌胃7天后，第8天灌胃30 min后，除空白組外，其余各組根據(jù)預實驗得到的細菌感染濃度，按0.5 mL每20 g的劑量注射相應濃度的菌懸液。觀察并統(tǒng)計四天內小鼠的死亡數(shù)。當有小鼠死亡時，無菌操作分別取出小鼠心、肺、腎、肝，分別放入30 mL的滅菌LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再將培養(yǎng)后的培養(yǎng)基涂在固體平板上，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌生長，挑取培養(yǎng)出的菌落，通過革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察形態(tài)，進行鑒定。非用藥組小鼠全部死亡后，同時處死其余各組剩余小鼠，以同樣的方法做各內臟的組織懸液培養(yǎng)。

1.4.6 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 野艾蒿各個提取組分對金黃色葡萄球菌的抑菌圈測定

由表1可以看出，野艾蒿各個組分對金黃色葡萄球菌的的抑菌圈大小順序為乙酸乙酯相＞正丁醇相＞石油醚相=揮發(fā)油。水相組分無抑菌活性。乙酸乙酯相為中度敏感，正丁相、揮發(fā)油和石油醚相都為低度敏感。研究表明乙酸乙酯部位主要含有一些黃酮、有機酸、酯等[2]。這些組分都具有一定的抑菌活性，也可能是乙酸乙酯部位抑菌活性最好的原因。具體是那種成分起主要的作用還有待進一步研究。

2.2 野艾蒿各組分對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）測定

表2 不同濃度的各組分的抑菌圈Table 2 Inhibitory circles of various components at different concentrations

由表2可以看出石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）依次為為10.00、2.50、5.0、10.00 mg/mL。

2.3 對金黃色葡萄球菌的生長曲線的影響結果

由抑菌圈的大小和最小抑菌濃度可以看出乙酸乙酯相和正丁醇相對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，因此研究了乙酸乙酯相和正丁醇相對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。結果如圖1所示，由圖可以看出，加入提取物的實驗組與空白組相比，金黃色葡萄球菌的生長明顯受到抑制（乙酸乙酯相p=0.0123＜0.05，正丁醇性p=0.0240＜0.05）。空白組在0～4 h處于生長適應期，4～12 h處于生長對數(shù)期，12～24 h后處于穩(wěn)定期24 h后處于衰亡期。實驗組在較長的時間處于生長適應期，沒有明顯的對數(shù)生長期，一直都處于緩慢增長。乙酸乙酯相比正丁醇相的抑制作用要更加明顯，更進一步說明了乙酸乙酯相的抑菌效果更好。

圖1 野艾蒿提取物對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig.1 Effect of extract of Artemisia vulgaris on growth curve of Staphylococcus aureus

2.4 乙酸乙酯相體內抑菌實驗結果

2.4.1 預實驗結果

由表3可知細菌濃度為30×108CFU/mL時小鼠死亡率為80%；細菌濃度為30×107CFU/mL時小鼠死亡率為50%；其他細菌濃度的組小鼠均未出現(xiàn)死亡，因此得出實驗所用感染小鼠的金黃色葡萄球菌濃度為 30×108CFU/mL。

2.4.2 體內實驗結果

由表4可以看出模型組的死亡率為90%，野艾蒿乙酸乙酯相低中高濃度組的死亡率分別為40%、20%、30%?？瞻捉M死亡率為 0，排除了飼養(yǎng)環(huán)境以及溶劑等其他因素引起小鼠的死亡。野艾蒿提取物可以顯著降低金黃色葡萄球菌感染引起的小鼠的死亡率。當灌胃濃度為0.5 g/kg時小鼠的死亡率（20%）比模型組的死亡率（90%）降低了77.8%。

中劑量的比低劑量的效果更好，高劑量的與中劑量沒有明顯的區(qū)別，且高劑量比中劑量的死亡率高，這可能是由于小鼠個體的差異及實驗操作不當造成的。

表3 不同濃度的金黃色葡萄球菌對小鼠的致死情況Table 3 Mortality of different concentrations of Staphylococcus aureus in mice

表4 各實驗組的小鼠死亡情況Table 4 Deaths of mice in each experimental group

小鼠死亡后，取出心、肺、肝、腎培養(yǎng)，空白組各內臟培養(yǎng)無細菌生長，模型組和給藥組的小鼠死亡后，各內臟培養(yǎng)均有細菌生長，且菌落形態(tài)一致，經過革蘭氏染色在顯微鏡下觀察菌體為球狀被染成紫色，確定為金黃色葡萄球菌(如圖2所示）。進一步說明小鼠的死亡是由于金黃色葡萄球菌感染引起的。心、肺、肝、腎培養(yǎng)后均有細菌生長，說明金黃色葡萄球菌可以感染小鼠的心、肺、肝、腎。

圖2 死亡小鼠心肺肝腎培養(yǎng)后的細菌革蘭氏染色照片F(xiàn)ig.2 Bacterial Gram stain photo of dead mice after heart, lung,liver and kidney culture

3 結論

野艾蒿是一種重要的天然藥用植物，在我國有很長的使用歷史。本文對野艾蒿提取物的體外及體內抑菌活性進行了研究。體外抑菌實驗表明各個組分對金黃色葡萄球菌的抑菌能力大小為：乙酸乙酯相＞正丁醇相＞石油醚相=揮發(fā)油萃取物。水相組分無抑菌活性。石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）依次為10.00，2.50，5.00，10.00 mg/mL。乙酸乙酯相與正丁醇相對金黃色葡萄球菌的生長曲線有明顯的影響（p＜0.05），使金黃色葡萄球菌的生長緩慢，無明顯的生長對數(shù)期。體內抑菌實驗表明野艾蒿乙酸乙酯相高低中濃度組均具體內抑菌活性，當灌胃濃度為0.5 g/kg時效果最好，小鼠的死亡率（20%）比模型組的死亡率（90%）降低了77.8%。