瑪咖生物堿對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402和H22荷瘤小鼠的抑制作用

王愛華，劉英梅，王麗麗，安然

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250001）（2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南 250001）

肝癌作為我國常見的惡性腫瘤之一，具有生長迅速、易擴(kuò)散等特點(diǎn)[1～4]?，F(xiàn)今用于腫瘤治療的藥物按原料差異可分為化學(xué)藥和中藥，化學(xué)藥物具有見效快等優(yōu)點(diǎn)，但是長期服用毒、副作用大，中藥抗腫瘤藥物作為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，已在控制肝癌病情的發(fā)展，介入肝癌治療等方面具有廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)今市場(chǎng)上存在一系列中藥抗腫瘤藥物，如參一膠囊。

瑪咖作為新資源食品，含有多糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，除此之外，含有生物堿、瑪咖烯、瑪咖酰胺、芥子油苷等活性成分，具有抗疲勞、抗氧化等[5～9]活性。生物堿作為瑪咖中有效活性成分，總結(jié)發(fā)現(xiàn)，其研究主要集中于抗疲勞、抗氧化、降血糖[10～12]，尚未涉及對(duì)抗腫瘤活性的研究。本試驗(yàn)通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)抗肝癌活性試驗(yàn)考察瑪咖生物堿抗腫瘤活性，以期為瑪咖生物堿的活性研究提供新的方向。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

7402肝癌細(xì)胞，由山東省醫(yī)科院提供；無水乙醇（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇（色譜純），Tedia公司；新生牛血清（FBS），浙江天材生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液，美國 GE Healthcare Life Sciences公司；DMSO(分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶，美國 GE Healthcare Life Sciences公司；磷酸緩沖溶液（PBS），博士得生物有限公司；注射用順鉑，齊魯制藥有限公司；青鏈霉素混合液（雙抗），北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；瑪咖，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民老師鑒定為植物瑪咖。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；分析天平（萬分之一），上海菁海儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；冰箱，青島海爾股份有限公司；紫外光柵分光光度計(jì)，萊伯泰科UV9100B；高效液相色譜儀（Agilent 1200型高效液相色譜儀），安捷倫公司；FA2004N電子天平，上海菁海儀器有限公司；MemmertCO2培養(yǎng)箱，北京五洲東方科技有限公司；CKX41顯微鏡，日本OLYMPVS公司；LEGEND MICRO17離心機(jī)，美國Thermo公司；Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；NEST 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，無錫耐恩生物科技有限公司；LDEX-70FBS型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；101-3型干燥箱，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.3.1 瑪咖生物堿的制備

1.3.1.1 瑪咖生物堿的提取與分離

將100 g瑪咖與0.5%的鹽酸95%乙醇于75 ℃下進(jìn)行加熱回流提取三次，每次2 h，藥物與溶劑比例為1 g：20 mL。合并提取液，雙層濾紙抽濾，將抽濾后的提取液進(jìn)行濃縮，得浸膏，后用0.5%的鹽酸洗，調(diào)節(jié)pH值為1～2，冷藏靜置24 h。將靜置后的溶液抽濾，棄去沉淀，用乙酸乙酯等按體積比為1:1進(jìn)行萃取三次，取水層將其濃縮至無乙酸乙酯味為止，后用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至10，冷藏靜置24 h，抽濾，沉淀用蒸餾水洗去殘留的氫氧化鈉，干燥，即得瑪咖生物堿。

1.3.1.2 瑪咖生物堿的測(cè)定

通過酸堿滴定法測(cè)定生物堿的含量，將定量過量0.01 mol/L的稀硫酸溶液中和瑪咖生物堿，再用0.02 mol/L的氫氧化鈉溶液標(biāo)定剩余的稀硫酸，計(jì)算出硫酸的剩余量，得到生物堿的含量，試驗(yàn)過程中以甲基紅為指示劑。生物堿純度按下式計(jì)算。

根據(jù)上述公式測(cè)得的瑪咖生物堿純度為88.91%。

1.3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

將肝癌細(xì)胞Bel-7402放于含有新生牛血清、青鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，后進(jìn)行細(xì)胞換液和傳代培養(yǎng)，將帶有細(xì)胞的培養(yǎng)液均勻地加在加樣槽中，吹打均勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，平均 4×104～6×104個(gè)細(xì)胞，然后用排槍吸取細(xì)胞加入96孔板中，放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h進(jìn)行肝癌細(xì)胞活力考察。

1.3.2.2 藥物處理與分組

將待測(cè)品用不含血清的 1640培養(yǎng)液溶解，通過0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，配成0.5 mg/mL瑪咖生物堿溶液、1 mg/mL瑪咖生物堿溶液、2 mg/mL瑪咖生物堿溶液，將其放入冰箱。等到細(xì)胞生成到約占每個(gè)孔的80%，將96孔板從培養(yǎng)箱中取出，拍出培養(yǎng)液，然后加入每個(gè)孔的藥物100 μL，每個(gè)濃度重復(fù)5個(gè)孔，以順鉑為陽性對(duì)照，1640培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，考察肝癌細(xì)胞活力。

1.3.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

避光條件下，每個(gè)孔加入MTT 20 μL，4 h后，用注射器將溶液吸出，加入DMSO，另外選取三個(gè)孔加入DMSO做空白，用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處的OD值，記錄數(shù)據(jù)。抑制率計(jì)算公式，如下：

抑制率=1-(加藥組平均 OD 值-較零組平均 OD值)/(陰性組平均OD值-較零組平均OD值)。

1.3.3 體內(nèi)抗腫瘤活性研究

1.3.3.1 H22肝腹水瘤的傳代及接種

將H22荷瘤小鼠正常喂養(yǎng)一周，在無菌環(huán)境下進(jìn)行腹水傳代，將傳代后的小鼠正常飼喂一周，脫頸椎處死，于無菌環(huán)境下吸取腹腔腹水，加入生理鹽水進(jìn)行稀釋，將混懸液進(jìn)行腋下接種，每只接種0.2 mL。

1.3.3.2 分組及給藥

將接種后的小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分為空白對(duì)照組（吐溫-80溶液）、荷瘤小鼠對(duì)照組（吐溫-80溶液）、單獨(dú)順鉑給藥組（順鉑：2 mg/kg）、生物堿低劑量給藥組（瑪咖生物堿：0.5 g/kg）、生物堿中劑量給藥組（瑪咖生物堿：1.0 g/kg）、生物堿高劑量給藥組（瑪咖生物堿：2.0 g/kg），正常喂養(yǎng)，并于接種后的第3日進(jìn)行灌胃給藥?？瞻捉M、荷瘤小鼠組：每只每天灌胃0.2 mL的吐溫-80；陽性藥組：每只每天注射0.2 mL的順鉑，連續(xù)給藥3 d后，停藥7 d，如此反復(fù)；單獨(dú)生物堿給藥組：每只每天灌胃0.2 mL的瑪咖生物堿吐溫-80溶液。

1.3.3.3 小鼠體重測(cè)定

將灌胃前小鼠與灌胃后小鼠分別測(cè)定體重，觀察是否有顯著性差異。

1.3.3.4 瘤重及抑瘤率的計(jì)算

連續(xù)用藥18 d后，將小鼠脫頸椎處死，稱取瘤重，計(jì)算各組藥物的抑瘤率。計(jì)算公式如下：

1.3.3.5 免疫指數(shù)計(jì)算

將 2.3.3中小鼠，取脾臟、胸腺，稱定重量，計(jì)算各組藥物的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上數(shù)據(jù)通過SPSS statistics 17.0方差分析進(jìn)行，One-Way ANOVA進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果分析

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 MTT法測(cè)定各組分對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖的影響（±s）

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)作為瑪咖生物堿抗肝癌活性的初步篩選試驗(yàn)。根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)瑪咖生物堿高劑量給藥組抑瘤率可達(dá)81.49%，表明瑪咖生物堿具有顯著的抗肝癌Bel-7402細(xì)胞的效果。并且瑪咖中、高劑量組抑瘤率達(dá)到50%以上，表明瑪咖生物堿具有有效的體外抗肝癌活性，且隨著劑量的增加，其抑瘤率逐漸增加，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。此細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供一定的參考。

表1 不同濃度的瑪咖生物堿對(duì)Bel-7402肝癌細(xì)胞的抑制率Table 1 Inhibition rate of different concentration of macaalkaloid on Bel-7402 hepatocellular carcinoma cells

2.1.2 藥物作用后肝癌細(xì)胞的形態(tài)變化

不同組的肝癌細(xì)胞Bel-7402在培養(yǎng)24 h后，通過顯微鏡觀察，其細(xì)胞形態(tài)變化如圖1。圖1a為肝癌細(xì)胞Bel-7402的正常形態(tài)，呈多邊形，用藥之后出現(xiàn)不同程度的萎縮，萎縮程度越明顯，則說明細(xì)胞抑制率越大。由圖1可以看出，不同給藥組對(duì)肝癌細(xì)胞均有不同程度的抑制作用?，斂飰A高劑量組＞瑪咖生物堿中劑量組＞瑪咖生物堿低劑量組。

圖1 不同組別細(xì)胞用藥24 h后的顯微成像Fig.1 Microimaging of cells in different groups after 24h of administration (×200)

2.2 小鼠體重變化結(jié)果

由圖2可知，瑪卡生物堿劑量組小鼠體重?zé)o顯著性差別。單獨(dú)順鉑給藥，小鼠減輕具有顯著性的差異，表明順鉑對(duì)小鼠體重存在一定的副反應(yīng)。相對(duì)空白組，不同劑量給藥組給藥后體重均有不同程度減輕，但無顯著性差異，表明，瑪咖生物堿相對(duì)市場(chǎng)上主要用于抗腫瘤的化療藥順鉑無顯著副作用。

圖2 各組給藥后小鼠體重變化情況Fig.2 Effects of different groups on weight (mean±SD)

2.3 體內(nèi)抗肝癌試驗(yàn)結(jié)果

表2 藥物對(duì)H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制率Table 2 Effects of different groups on tumor weight (mean±SD)

圖3 不同組別小鼠瘤重Fig.3 Effects of different groups on tumor weight (mean±SD)

如表中所示，陽性藥順鉑與荷瘤小鼠對(duì)照組相比具有顯著的抑制作用；單獨(dú)中、高劑量生物堿給藥組相對(duì)荷瘤小鼠對(duì)照組，抑制率分別為49.88%、50.88%，具有顯著的抑瘤效果，但是抑瘤率相差不大，分析原因可能是因?yàn)殡S著劑量的增加，抑瘤率增加，但是有效含量有一定的閾值，因此劑量的再次增加，使得藥效不在顯著提高，而瑪咖生物堿低劑量組尚未達(dá)到有效含量，因此沒有顯著地抗腫瘤活性。

2.4 免疫指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 不同組別對(duì)免疫指數(shù)的影響Fig.4 Effects of different groups on immune index

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，順鉑單獨(dú)給藥組，其脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯減輕，且具有顯著性差異，分析原因，可認(rèn)為，順鉑化療藥治療腫瘤具有一定的毒性，而不同劑量組瑪咖生物堿抗腫瘤活性與免疫活性無顯著性關(guān)聯(lián)，瑪咖生物堿抗腫瘤的機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。

3 結(jié)論

3.1 惡性腫瘤是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類生命安全與健康的主要問題之一。市場(chǎng)上現(xiàn)今主要治療腫瘤的藥物分為化藥和中藥提取物等?；幋嬖谝娦Э欤?、副反應(yīng)大的缺點(diǎn)。中藥提取物符合傳統(tǒng)中醫(yī)理論扶正祛邪的觀點(diǎn)，使得藥物的毒、副作用減輕。

3.2 現(xiàn)今，對(duì)瑪咖生物堿的研究主要集中于抗疲勞等，并未對(duì)抗腫瘤活性進(jìn)行涉及，本試驗(yàn)創(chuàng)新性的探究瑪咖生物堿抗腫瘤活性。本試驗(yàn)將瑪咖采用酸溶堿沉方法獲得純度為 88.91%的瑪咖生物堿，并采用Bel-7402細(xì)胞進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行活性篩選，確定不同劑量瑪咖生物堿在體內(nèi)、外抗肝癌活性的影響。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瑪咖生物堿高、中、低劑量組均對(duì)肝癌細(xì)胞有一定的抑制作用，其抑瘤率為：瑪咖生物堿高劑量組＞瑪咖生物堿中劑量組＞瑪咖生物堿低劑量組，呈現(xiàn)計(jì)量相關(guān)性。

3.3 通過進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定不同劑量組瑪咖生物堿對(duì)抗H22荷瘤小鼠的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瑪咖生物堿高、中劑量均有顯著的抗腫瘤活性，抑瘤率分別為50.88%、49.88%。相對(duì)陽性藥順鉑組相比，不同瑪咖生物堿給藥組抑瘤率雖然低于陽性藥組，但是其免疫指數(shù)（脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)）與空白組相比沒有顯著性的差異，表明，瑪咖生物堿相對(duì)市場(chǎng)上普遍使用的陽性藥順鉑毒、副作用小。并且瑪咖生物堿抗肝癌活性與免疫調(diào)節(jié)無關(guān)，具體抗肝癌機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。此實(shí)驗(yàn)研究為瑪咖生物堿活性研究研究提供新的思路與方向，同時(shí)為抗肝癌活性的研究提供新的參考。