6-姜烯酚誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡及與VEGFR2表達(dá)變化的關(guān)系

王宇鋒，孫游，李海，楊春

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心，上海 200127）（2.上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院眼科，上海 201900）（3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏銀川 750004）

結(jié)直腸癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新臨床數(shù)據(jù)表明，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)病率已位居惡性腫瘤的第三位，而死亡率位居第四位[1]。在我國(guó)，尤其是近年來(lái)隨著居民物質(zhì)生活水平的不斷提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率一直呈現(xiàn)升高態(tài)勢(shì)，且發(fā)病多在 40歲以后，男女之比例大約為 2:1，嚴(yán)重危害了人們的生存質(zhì)量[2]。結(jié)直腸癌早期得到確診的只有 5%，60～70%的結(jié)直腸癌患者就診時(shí)已是中晚期，結(jié)直腸癌患者的5年生存率：I期為93%，II期約為80%，III期約為60%，IV期約為8%，早期診斷能明顯提高患者生存率[3]。目前外科手術(shù)輔助放、化療治療手段仍是治療結(jié)直腸癌的主要方法，但是卻給患者帶來(lái)了巨大的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力[4]。故探索結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)于尋找新的治療方案，降低結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病率和死亡率具有很大的意義。

近年來(lái)，根據(jù)最新調(diào)查研究表明[5]，飲食因素和飲食習(xí)慣的改變與結(jié)直腸癌的關(guān)系甚為緊密，這為結(jié)直腸癌的有效預(yù)防和控制提供了更深層次、更全面的依據(jù)。而生姜作為一種膳食補(bǔ)充劑、調(diào)味作料和中藥成分，姜酚和姜辣素是其中最主要的辣味活性物質(zhì)[6]，當(dāng)遇熱后，姜酚一方面通過(guò)醇醛縮合化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為脂肪醛和姜油酮，另一方面可以通過(guò)脫水反應(yīng)生成6-姜烯酚[7]，而其中 6-姜烯酚（6-shogoal，6S）不僅具有提高機(jī)體免疫力[8]、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[9]、殺菌消毒[10]、止吐[11]等功效，還可有效抑制平滑肌細(xì)胞增殖[12]、抑制腫瘤增殖[13]等特性。

本研究擬通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡，并檢測(cè)VEGFR2蛋白的表達(dá)水平變化，進(jìn)而探討6-姜烯酚抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖的相關(guān)可能機(jī)制，旨在為進(jìn)一步研究6-姜烯酚抑制結(jié)直腸腫瘤增殖的相關(guān)靶點(diǎn)或具體機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

6-姜烯酚純度97%，購(gòu)自于成都德瑞可生物科技有限公司；Mc Coy's 5A培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）進(jìn)口于美國(guó)GIBCO公司；1.5 M TRIS HCL緩沖液、1.0 M TRIS HCL緩沖液、Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、甲醇、TBST、TEMED均購(gòu)自于美國(guó) Sigma公司；雙抗（青霉素加鏈霉素）、10×Loading Buffer、CCK8試劑盒、BCA蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于南京凱基生物公司；脫脂牛奶、ECL顯色液購(gòu)于新西蘭生物公司；0.45 umPVDF膜、抗VEGFR2抗體（鼠抗人，1:2000稀釋?zhuān)┵?gòu)于 ABCAM 公司；30%聚丙烯酰胺購(gòu)于 Bio-Rad Laboratories（Berkeley，CA）；蛋白marker（10～180 Ku）、Tween20、山羊抗兔 IgG抗體（含辣根酶）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)GIBCO公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)（Bio-Rad，型號(hào)ESCO AC2）；相差倒置熒光顯微鏡（型號(hào)CKX 41），日本NICON公司；NICON圖像采集系統(tǒng)（型號(hào)MM 200），日本NICON公司；Bio-Rad凝膠成像分析儀（型號(hào)Gel Doc 2000），美國(guó) Bio-Rad公司；-80 ℃低溫冰箱（型號(hào)FYL-YS-81A），日本SANYO公司；-20 ℃冰箱（型號(hào) BCD-205 HK）青島海爾公司；4 ℃冰箱（型號(hào)BD-105 DEW），青島海爾公司；低溫高速離心機(jī)（型號(hào)5430 R），美國(guó)EPPENDORF公司；電子天平（型號(hào)FA 1004），上海京孚儀器有限公司；水平脫色搖床（型號(hào)WD-9405 C/D），江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HT29（原位結(jié)腸癌細(xì)胞）細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)（American type culture collection），單層貼壁生長(zhǎng)，集落形成率40%，裸鼠致瘤性100%。細(xì)胞培養(yǎng)條件：Mc Coy's 5A培養(yǎng)基+10%胎牛血清+0.1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素），置于37 ℃、95% O2、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與常規(guī)培養(yǎng)

將Mc Coy's 5A培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）提前室溫或 37 ℃溫箱內(nèi)預(yù)熱處理，并將可能用到的實(shí)驗(yàn)耗材（15 mL、50 mL離心管，EP管，1.5 mL凍存管，微量加樣器，各型槍頭等）提前放在超凈工作臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)紫外線(xiàn)燈照射 30～40 min，調(diào)整水浴鍋溫度至37.5 ℃，快速?gòu)囊旱拗刑岢鏊枰?.5 mL凍存管，將其底部半浸入水浴鍋內(nèi)快速震蕩1 min左右，待到1.5 mL凍存管內(nèi)的凍存細(xì)胞液迅速融化后，立即轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)內(nèi)，移液器吸出凍存液并及時(shí)轉(zhuǎn)入已經(jīng)提前加入了2～3 mL含胎牛血清和雙抗（100 U/m L青霉素、100 mg/L鏈霉素）培養(yǎng)基的15 mL離心管內(nèi)，混勻后低溫高速離心機(jī)離心（4 ℃，1500 r/min，5 min），吸除上清液，并向離心管內(nèi)加入1～2 mL預(yù)先配好的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕均勻混懸細(xì)胞后繼續(xù)轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿，并在培養(yǎng)皿上標(biāo)識(shí)細(xì)胞系名稱(chēng)及復(fù)蘇時(shí)間，置于37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

1.2.2 分組藥物干預(yù)

設(shè)立 4組不同濃度藥物干預(yù)組：HT29-對(duì)照（DMSO）、HT29-6姜烯酚（10 μM）、HT29-6姜烯酚（20 μM）、HT29-6 姜烯酚（40 μM）組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，應(yīng)用相差倒置顯微鏡觀(guān)察不同濃度6-姜烯酚對(duì)不同分組細(xì)胞增殖的影響及細(xì)胞形態(tài)的不同變化，并拍照。

1.2.3 CCK8法制作細(xì)胞抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)不同分組細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)量，再按比例接種培養(yǎng)細(xì)胞，在96孔板中按照1:2比例依次加入用Mc Coy's 5 A培養(yǎng)基等比例稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度（0、5、10、15、20、25、30、40、45、50 μL），每組設(shè)置3 到6 個(gè)副孔，再將 96孔板內(nèi)按比例接種的細(xì)胞懸液配成 100 μL/孔，最后置于37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，將細(xì)胞培養(yǎng)板在37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，調(diào)至酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞孔的光密度值。按照公式抑制率=1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值（Optical Density），并計(jì)算出細(xì)胞存活率及抑制率=50%時(shí)的藥物濃度，即IC50。

1.2.4 提取細(xì)胞蛋白，并測(cè)定蛋白含量

將所培養(yǎng)的不同分組細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液全部吸除，根據(jù)比例（10 mL:150 mm培養(yǎng)板）加入之前4 ℃冰箱預(yù)冷處理的PBS液重復(fù)沖洗2～3遍，搖晃均勻，最大限度的吸除培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，在1 mL預(yù)冷的Lysis Buffer中分別加入10 μL磷酸酶抑制劑、5 μL 100 mM PMSF及1 μL蛋白酶抑制劑，加入并充分晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于冰上保存1～2 h待用。PBS重復(fù)細(xì)胞洗滌2～3次后，再次將細(xì)胞及其懸液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的15或50 mL離心管中，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和培養(yǎng)皿大小加入上述配置的冷Lysis Buffer，最后將加入裂解液的細(xì)胞培養(yǎng)皿再次置于4 ℃水平搖床平臺(tái)上，劇烈震蕩30 s，再次放置于冰上4～5 min，重復(fù)本次操作4～5次，低溫高速離心機(jī)內(nèi)離心（12000 r/min，4 ℃，5 min），吸出離心管內(nèi)上清液即為細(xì)胞全蛋白提取物，細(xì)胞蛋白含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白分子量后分裝保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將所培養(yǎng)的不同分組細(xì)胞，先用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取 5×105～1×106個(gè)/mL細(xì)胞，低溫高速離心機(jī)內(nèi)離心（1500 r/min，4 ℃，10 min），棄上清液，加入1 mL預(yù)冷的PBS，充分搖晃均勻使細(xì)胞懸浮，再次低溫高速離心機(jī)內(nèi)離心（1500 r/min，4 ℃，10 min），棄上清。重復(fù) 2～3次，將細(xì)胞重懸于 200 μL Binding Buffer，加入10 uL Annexin V-FITC輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μL Binding Buffer（總反應(yīng)體積500 μL）以及5 μL PI，1小時(shí)內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行觀(guān)察、記錄檢測(cè)結(jié)果，并繪制細(xì)胞凋亡結(jié)果圖進(jìn)行比較。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡周期

加入不同濃度的6-姜烯酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，消化、收集不同分組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞 2～3次，并低溫高速離心機(jī)內(nèi)離心（2000 r/min，4 ℃，5 min），棄上清液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL細(xì)胞。取1 mL上述細(xì)胞懸液，加入體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500 μL進(jìn)行固定，過(guò)夜，4 ℃冰箱保存，染色前用PBS洗去固定液2～3次，加入100 μL RNaseA后置于37.5 ℃水浴鍋中30 min，再加入400 μL PI染色均勻，4 ℃冰箱內(nèi)避光、保存30 min，最后在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)處檢測(cè)周期變化。

1.2.7 Western-Blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

根據(jù)上述操作所測(cè)蛋白樣品濃度，將不同分組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳100 V，1.5～2 h（濃縮膠5%、分離膠10%），然后電轉(zhuǎn)液中濕性電轉(zhuǎn)100 V、1 h，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，4%脫脂奶粉37 ℃封閉1.5～2 h，水平搖床搖勻，加入相應(yīng)的抗體VEGFR2（1:2000稀釋?zhuān)ⅵ?actin（1:1500稀釋?zhuān)? ℃冰箱孵育、過(guò)夜。應(yīng)用1%TBST洗膜2～3次，加入相應(yīng)的二抗（鼠抗兔）進(jìn)行免疫雜交反應(yīng)，37.5 ℃室溫孵育2 h，再用1% TBST洗膜2～3次后，最后再加入適宜劑量的ECL顯色液（A液和B液在EP管內(nèi)等體積混合），在暗室凝膠成像儀下曝光成像，并用掃描儀掃描出膠片圖像，采用凝膠圖像分析軟件（Quantity One）對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次，取其平均值

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用ANOVA方差分析，p≤0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 6-姜烯酚可明顯抑制HT29細(xì)胞增殖

不同分組HT29加入不同濃度6-姜烯酚干預(yù)后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在相差倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及形態(tài)變化（放大倍數(shù)：40×10 倍）。

結(jié)果如圖1所示，陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，隨著6-姜烯酚濃度由10 μM增加到40 μM，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯受抑制，活性較差，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞間連接減少，脫離較多，且隨藥物濃度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)活性受影響越明顯。

圖1 顯微鏡下不同濃度6-姜烯酚干預(yù)HT29 24 h后細(xì)胞的形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of HT29 intervened under different concentrations of 6-shogoal by microscope after 24 h（±s，n=3）

2.2 CCK8法檢測(cè)藥物干預(yù)后細(xì)胞抑制率變化

圖2 CCK8法檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚對(duì)HT29增殖能力的調(diào)控Fig.2 CCK8 assay was used to detect the proliferation of HT29 at different concentrations of 6-shogoal (24 h)（±s，n=3）

不同分組細(xì)胞培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1～4 h，并用酶標(biāo)儀測(cè)在490 nm處檢測(cè)、記錄吸光度值，并計(jì)算出細(xì)胞抑制率。結(jié)果如（圖 2）顯示，與陰性對(duì)照組相比，HT29-6姜烯酚組細(xì)胞存活抑制率明顯升高，尤其在HT29-6姜烯酚濃度達(dá)到40 μM時(shí)細(xì)胞存活抑制率升高更為明顯（p＜0.05）；并計(jì)算出 6-姜烯酚對(duì)HT29 細(xì)胞的IC50為 18.7 μmol/L。

2.3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 6-姜烯酚誘導(dǎo)HT29凋亡

國(guó)內(nèi)有報(bào)道研究[14]，在研究6-姜烯酚對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的抑制作用中發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚（20 μM）通過(guò)促進(jìn)FTL（Recombinant Ferritin，Light Polypeptide）、GCLC（谷氨酰半胱胺酸合成酶抗體）、核蛋白Nrf2（核因子E2相關(guān)因子2）表達(dá)及抑制Keap1（Kelch like ECH Associated Protein 1）、胞漿蛋白中Nrf2表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116發(fā)生凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。還有研究表明[15]，Tan通過(guò)對(duì)微陣列基因表達(dá)譜和連通圖的進(jìn)一步分析對(duì)比中發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚是通過(guò)激活PPARγ（peroxisome proliferator activated receptor-γ）介導(dǎo)的分子信號(hào)通路來(lái)增加其對(duì)腫瘤增殖的抑制作用。而本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的各分組細(xì)胞（HT29）分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，從熒光雙參數(shù)點(diǎn)圖可以觀(guān)察（圖3），其中右上象限和右下象限為死亡細(xì)胞數(shù)。與陰性對(duì)照組相比，HT29-6姜烯酚組隨著藥物濃度由低-中-高，右上象限和右下象限死亡細(xì)胞數(shù)明顯不同程度增加（p＜0.05）。從而證實(shí)6-姜烯酚可以誘導(dǎo)HT29發(fā)生凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

圖3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人HT29凋亡Fig.3 Annexin V-FITC/pI flow cytometry was used to detect the apoptosis of human HT29 induced by 6-shogoal (±s，n=3)

2.4 細(xì)胞凋亡周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè) 6-姜烯酚誘導(dǎo)HT29凋亡后細(xì)胞增殖周期改變

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)[16]，6-姜烯酚可誘導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞SW480發(fā)生凋亡，并導(dǎo)致G0/G1期的細(xì)胞數(shù)由高降到低，而G2/M期的細(xì)胞數(shù)由低到高，致使該細(xì)胞增殖周期被阻斷在G2/M期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。同時(shí)趙行宇[17]在研究 6-姜烯酚對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡及其機(jī)制實(shí)驗(yàn)中指出不同濃度 6-姜烯酚處理胃癌細(xì)胞24 h后，隨藥物濃度增加，胃癌BGC-823細(xì)胞的早期凋亡率也呈現(xiàn)升高態(tài)勢(shì)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的各分組細(xì)胞（HT29）分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，如表1所示，可以觀(guān)察到 HT29-6姜烯酚組隨著藥物濃度由低-中-高，細(xì)胞增殖周期中各期細(xì)胞構(gòu)成比發(fā)生明顯變化。與陰性對(duì)照組相比，其中G0/G1期的細(xì)胞數(shù)由49.48%下降到24.39%和17.18%（p＜0.05），而G2/M期的細(xì)胞數(shù)由3.44%增加到34.78%和49.54%（p＜0.05），提示HT29細(xì)胞被阻斷在G2/M期。

表1 細(xì)胞凋亡周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人HT29凋亡細(xì)胞周期變化Table 1 The cell cycle changes of apoptosis induced by different concentrations of 6-shogoal in human HT29 were detected by cell cycle detection kit (±s，n=3)

表1 細(xì)胞凋亡周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人HT29凋亡細(xì)胞周期變化Table 1 The cell cycle changes of apoptosis induced by different concentrations of 6-shogoal in human HT29 were detected by cell cycle detection kit (±s，n=3)

注：與對(duì)照組相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

6-姜烯酚濃度/μM G0/G1/% S/% G2/M /%0 49.48±0.46 47.08±0.29 3.44±0.73 10 37.64±0.67* 38.47±1.34* 23.89±0.85*20 24.39±0.99* 40.83±1.12* 34.78±0.82*40 17.18±1.12* 33.28±1.46* 49.54±1.23*

2.5 6-姜烯酚可不同程度抑制VEGFR2的表達(dá)

國(guó)內(nèi)學(xué)者劉洪金[18]在研究貝伐珠單抗對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞VEGFR1和VEGFR2表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)下調(diào)，卻使VEGF相關(guān)受體（VEGFR1、VEGFR2）表達(dá)升高，而VEGFR1和VEGFR2可直接不同程度的提高腫瘤新生血管的生長(zhǎng)、侵襲能力，間接導(dǎo)致了貝伐珠單抗對(duì)新血管新生和腫瘤侵襲的抑制作用減弱，進(jìn)而產(chǎn)生臨床耐藥性。同時(shí)還有報(bào)道[19]在研究不同濃度的藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡與VEGFR2蛋白的表達(dá)影響一文中指出，藤黃酸可以誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480發(fā)生凋亡，并使SW480細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，而VEGFR2蛋白的表達(dá)隨藥物濃度的增加而減少，進(jìn)而推斷其作用機(jī)制可能與抑制VEGFR2表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示如圖4（a、b）所示，藥物干預(yù)4組細(xì)胞24 h后，與陰性對(duì)照組比較，Western-blot檢測(cè)不同濃度的6-姜烯酚對(duì)VEGFR2表達(dá)水平呈現(xiàn)不同程度降低（p＜0.05），提示6-姜烯酚誘導(dǎo)HT29凋亡進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，可能與不同程度抑制VEGFR2有關(guān)。

圖4 Western-blot 檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚對(duì)HT29中VEGFR2表達(dá)的影響Fig.4 The effect of 6-shogoal on the expression of VEGFR2 in HT29 was detected by Western-blot（±s，n=3）

3 結(jié)論

3.1 細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物整個(gè)生命過(guò)程中不可缺少的環(huán)節(jié)，對(duì)機(jī)體內(nèi)損傷、衰老細(xì)胞的清除、更新及各組織器官的發(fā)育都起著十分重要的作用[20,21]。近年來(lái)，細(xì)胞凋亡越來(lái)越受到廣大科研工作者的關(guān)注，目前發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞的凋亡過(guò)程主要有以下四種：外部凋亡途徑（經(jīng)死亡受體介導(dǎo)）、內(nèi)部凋亡途徑（經(jīng)線(xiàn)粒體介導(dǎo)）、細(xì)胞凋亡途徑（經(jīng)B粒酶介導(dǎo)）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[22]。一般情況下，細(xì)胞凋亡過(guò)程都會(huì)受到機(jī)體嚴(yán)格、緊密的調(diào)控，以維持機(jī)體各組織器官的正常發(fā)育和免疫系統(tǒng)的建立[23]。

3.2VEGFR2（血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2)，又稱(chēng)FLK-1，一般存在于血管和淋巴管內(nèi)皮等處。VEGFR2可與VEGF-C、VEGF-D等結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，其還具有介導(dǎo)淋巴管和血管的新生，有效調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的遷移等功能[24]。眾所周知，血管生長(zhǎng)因子和血管生長(zhǎng)抑制因子共同調(diào)節(jié)新生血管的形成，其中最主要的影響因子是VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）及其受體 VEGFR-2，而VEGFR-2作為VEGF調(diào)節(jié)新生血管生成的核心因子，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化以及腫瘤新生血管的形成都具有重大的意義[25]。張靖宇[26]在探討胰島素樣生長(zhǎng)因子 1受體(IGF-1R)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)意義中發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中IGF-1R、VEGFR2及mRNA表達(dá)明顯升高，且蛋白的表達(dá)水平受到結(jié)直腸腫瘤組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后輔助化療的影響，并指出IGF-1R和VEGFR2聯(lián)合檢測(cè)可為結(jié)直腸癌患者的靶向治療提供臨床依據(jù)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上可以發(fā)現(xiàn)隨著 6-姜烯酚濃度由低到高，細(xì)胞生長(zhǎng)活性狀態(tài)明顯受抑制，且隨藥物濃度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)活性受影響越明顯，具有濃度依賴(lài)性。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚可誘導(dǎo)HT29發(fā)生凋亡，并致使細(xì)胞增殖周期被G2/M期，干擾了DNA合成和有絲分裂，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖。而 Western-blot 檢測(cè)不同濃度的 6-姜烯酚對(duì)VEGFR2表達(dá)水平卻呈現(xiàn)不同程度降低，提示6-姜烯酚誘導(dǎo)HT29凋亡進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，可能與不同程度抑制VEGFR2有關(guān)。

3.4 本研究結(jié)果雖然證實(shí)了 6-姜烯酚誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡可能與不同程度地抑制VEGFR2表達(dá)水平有關(guān)，但是6-姜烯酚是否通過(guò)影響其它凋亡途徑或者具體的抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞機(jī)制是與哪些信號(hào)通路有關(guān)尚未完全明確，還需要進(jìn)一步更加系統(tǒng)、深入的研究。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)6-姜烯酚的不斷深入研究，其對(duì)結(jié)直腸癌的具體相關(guān)機(jī)制或信號(hào)通路必將更加明確，也必將為我們針對(duì)結(jié)直腸癌的診治提供更加廣闊的空間。