王娜妮 許平翠 張 揚 壽 旦
浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007
骨髓炎具有病程長、反復(fù)發(fā)作、易致殘等特點,是骨科復(fù)雜病種。淫羊藿-仙茅是常用治療骨病的溫補腎陽藥對,能促進成骨細胞生長,修復(fù)骨缺損。本研究采用骨髓炎兔模型,研究淫羊藿和仙茅配伍前后有效成分的體內(nèi)藥動學(xué)行為變化,探討藥對配伍協(xié)同增效的機制。
1.1 實驗動物:雄性新西蘭兔,3月齡,體質(zhì)量為2.2±0.1kg,浙江省實驗動物中心提供。動物質(zhì)量合格證號:SYXK(浙)2017-0009。
1.2 藥品:淫羊藿、仙茅飲片購自華東醫(yī)藥公司,經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院俞忠明副主任中藥師鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomu Maxim.的干燥葉和石蒜科植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根莖。對照品淫羊藿苷(純度≥98%,批號:489-32-7)、朝藿定A(純度≥98%,批號:MUST-12062311)、朝藿定B(純度≥98%,批號:MUST-12062312)、朝藿定C(純度≥98%,批號:MUST-12062313)、仙茅苷(純度≥98%,批號:85643-19-2)、苔黑酚葡萄糖苷(純度≥98%,批號:15072213)均購自北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司。
1.3 試劑與儀器:甲醇、乙腈均為色譜純(德國Merk公司);生理鹽水(批號:A16032301)購自浙江科倫制藥有限公司。其他試劑均為分析純。Xevo TQD超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Waters);Smart2Pure UV/UF超純水儀(美國Thermal fisher);AE240電子天平(瑞士Mettler);Microfuge 20R離心機(美國Beckman coulter);Lab dancer S25渦旋振蕩混合器(德國Ika)。
1.4 藥對及單味藥材提取物的制備:取淫羊藿、仙茅各10g,混合,加藥材重量20倍量的水,煎煮1h,濾過,藥渣加20倍量的水,煎煮1h,濾過,合并2次煎煮液,濃縮至生藥含量為淫羊藿和仙茅各1.5g/ml的水提液。取淫羊藿、仙茅藥材各10g,分別單煎,加水量、煎煮次數(shù)及方法同藥對水提液制備方法,制備生藥含量均為1.5g/ml的淫羊藿水提液及仙茅水提液。
1.5 骨髓炎兔模型制備及分組:參照課題組前期已建立的造模方法[1],進行造模手術(shù),術(shù)后4周驗證模型。造模成功的骨髓炎兔隨機分為:模型組、淫羊藿組、仙茅組、藥對組,每組3只。
1.6 給藥及血漿制備:除模型組外,其余各組采用清創(chuàng)手術(shù)-局部抗炎-灌胃給藥治療方案:按50mg/只的萬古霉素給藥劑量,病灶局部置入載萬古霉素硫酸鈣。淫羊藿組給予6g/kg/d淫羊藿提取液,仙茅組給予6g/kg/d仙茅提取液,藥對組給予6g/kg/d淫羊藿+6g/kg/d仙茅的藥對提取液。另取正常動物設(shè)空白對照組。給藥前12h禁食,自由飲水,給藥后8h統(tǒng)一禁食。連續(xù)灌胃給藥5d。第5d灌胃后,分別在后0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、10.0、20.0、30.0h,兔耳緣靜脈取血0.3ml,將血液置入裝有肝素鈉抗凝的離心管中,4℃下5000rpm迅速離心10min,取上清液即為含藥血漿。
1.7 血漿藥物濃度檢測:分述如下。
1.7.1 血漿樣品預(yù)處理:精密量取血漿100μl,加入500μl乙腈漩渦混勻,5000rpm離心10min,上清液氮氣吹干,100μl流動相[0.1%甲酸乙腈(A)∶0.1%甲酸水溶液(B)=24∶76(v/v)]復(fù)溶,12000rpm離心10min,取上清液待色譜分析。
1.7.2 對照品溶液的配制:分別精密稱取6種對照品適量,分別用乙腈溶解配置為質(zhì)量濃度為1mg/ml的母液,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前分別精密吸取一定量的對照品母液,用流動相[0.1%甲酸乙腈(A)∶0.1%甲酸水溶液(B)=24∶76(v/v)]稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00μg/ml的對照品溶液。
1.7.3 液相色譜條件:Capcell C18色譜柱(250.0mm×4.6mm,5μm),柱溫30℃,進樣量10μl,流速1.0ml/min。
流動相為0.1%甲酸乙腈(A)∶0.1%甲酸水溶液(B)=24∶76(v/v),檢測波長270nm。
1.8 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 色譜分析和方法學(xué)考察:取7份100μl空白血漿,加入不同質(zhì)量濃度的100μl混標溶液,按1.7.1項下方法操作,在1.7.3項下條件測定,結(jié)果見圖1。6個主要有效成分線性范圍均為0.0100-10.0000μg/ml,回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r):苔黑酚葡萄苷:Y=0.0018X+0.0025,r=0.9993;仙茅苷:Y=0.0716X+0.0025,r=0.9994;朝藿定A:Y=0.2345X+0.0041,r=0.9993;朝藿定B:Y=0.2634X+0.0350,r=0.9997;朝藿定 C:Y=0.1611X+0.0625,r=0.9999;淫羊藿苷:Y=0.0356X-0.0201,r=0.9998。該方法的日內(nèi)和日間精密度RSD(n=6)均小于5%,血漿經(jīng)冷藏(-80℃、3d)和反復(fù)凍融(3次)后各成分RSD(n=3)均小于10%,平均加樣回收率均在85%~105%之間,符合檢測要求。
2.2 藥動學(xué)參數(shù)計算和分析:淫羊藿和仙茅配伍前后給藥各成分在骨髓炎兔體內(nèi)的血藥濃度-時間曲線見圖2。血藥濃度數(shù)據(jù)采用藥動學(xué)計算軟件3p97擬合,采用非房室模型計算藥動學(xué)參數(shù),灌胃淫羊藿仙茅水提物后,各有效成分在骨髓炎兔體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)見表1。
圖1 淫羊藿仙茅藥對主要有效成分HPLC色譜圖
圖2 淫羊藿仙茅藥對給藥后各成分的藥時曲線
表1 淫羊藿和仙茅配伍前后淫羊藿苷和仙茅苷的藥動學(xué)參數(shù)比較
骨髓炎合并有死骨形成、成骨活性下降、局部血液循環(huán)差等問題,是病灶清除后骨缺損難以修復(fù)的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)抗生素植入技術(shù)結(jié)合淫羊藿、仙茅口服給藥有較強的抗感染能力和較好的成骨活性,能在病灶徹底清除后,有效發(fā)揮骨修復(fù)作用。中藥配伍可以影響有效成分在體內(nèi)的吸收和代謝。淫羊藿和仙茅均可溫補腎陽,相須為用,相得益彰。本實驗研究了淫羊藿仙茅配伍前后6種主要有效成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、苔黑酚葡萄糖苷、仙茅苷在骨髓炎兔體內(nèi)的藥動學(xué)行為,發(fā)現(xiàn)配伍顯著影響其在骨髓炎兔體內(nèi)的藥動學(xué)行為,使其血藥濃度增加,體內(nèi)清除速率減慢,生物利用度增加,從而促進藥物進入病變部位,延長藥物在體內(nèi)的滯留時間,發(fā)揮協(xié)同增效作用。從藥動學(xué)角度闡明了仙茅和淫羊藿配伍治療骨髓炎骨不連的合理性。