酶輔助閃式法提取蓮蓬中原花青素的工藝研究

王建美 高紅 徐巧娜

[摘要] 目的 研究閃式提取法提取蓮蓬中的原花青素的工藝條件。 方法 以蓮蓬中原花青素得率為評價指標，單因素試驗考察提取溶劑乙醇的體積分數(shù)、提取時間、提取次數(shù)、料液比等對蓮蓬中原花青素提取工藝的影響。以乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間及空白為考察對象，進行四因素三水平的正交試驗。確定最佳提取工藝參數(shù)。 結果 最佳工藝條件為：乙醇的體積分數(shù)為60%，提取時間為3 min，液料比40∶1。 結論 采用最佳工藝條件，蓮蓬原花青素得率為8.12%，與傳統(tǒng)提取法比較具有高效、省時等優(yōu)點。

[關鍵詞] 原花青素；蓮蓬；閃式提取；正交試驗；紫外分光光度法

[中圖分類號] R284.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（a）-0025-04

[Abstract] Objective To research on extraction process of proanthocyanidins from seedpod of lotus with homogenate extraction method. Methods Taking the proanthocyanidins yield of seedpod of lotus as the evaluation index， single factor test was used to investigate the effect of volume fraction of solvent extraction， ethanol extraction time， extraction times and solid-liquid ratio on the extraction of procyanidins from seedpod of lotus. The orthogonal tests of four factors and three levels were carried out with ethanol volume fraction， material liquid ratio， extraction time and blank as the object of study. The optimum extraction process parameters were determined. Results The results showed that the optimum process conditions were as followed， the volume fraction of ethanol was 60%， the extraction time was 3 min， and the liquid material ratio was 40∶1. Conclusion With this condition， the proanthocyanidins yield of seedpod of lotus is 8.12%. Compared with the traditional extraction method， the flash method has the advantages of high efficiency and less time.

[Key words] Procyanidins； Seedpod of lotus； Homogenate extraction； Orthogonal test； Ultraviolet spectrophotometry

蓮蓬是睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物蓮（Nelumbo nucifera Graertn.）的成熟花托，其作為蓮產品的副產物，資源十分豐富，但在蓮加工過程中常常被作為垃圾丟棄。有報道[1-6]，蓮蓬中含有較為豐富的原花青素。原花青素是國際上目前公認最有效的清除人體內自由基的天然抗氧化劑，其自由基清除能力和抗氧化功能是維生素E和維生素C的數(shù)十倍，能預防和治療八十多種因自由基引起的疾病，同時也能改善人體微循環(huán)[7-9]。此外，它還有抗炎、抗衰老、抗癌變、保護心血管、防止動脈硬化和調節(jié)免疫等功能[10-15]。由于原花青素強大的抗氧化活性，以及易溶于極性溶劑，再加上其顏色鮮艷亮麗等特點，符合人們回歸自然的需求，常被作為原料或添加劑應用到日化用品、食品、保健品等領域。目前，原花青素的提取方法有水溶劑提取法、有機溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法、超臨界提取法等[16-20]。各提取方法都存在一些優(yōu)缺點。酶解閃提法是在酶解提取的基礎上，應用閃式提取器破碎植物組織，從而使有效成分從植物體中大量溶出的一種提取方法，具有快速、簡便、無需加熱等特點。本實驗采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)選蓮蓬中原花青素的酶輔助閃式提取工藝，為蓮蓬中原花青素的工業(yè)提取法和蓮產業(yè)資源的綜合開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JHBE-50T閃式提取器（河南金鼎科技發(fā)展有限公司）；SB30001電子天平（上表電子儀器廠）；721型紫外可見分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）；EYELA SB-1100旋轉蒸發(fā)儀；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；101型電熱恒溫干燥箱（中國龍口市先科儀器公司）。

1.2 試藥

蓮蓬：采摘于浙江省金華市武義縣，經金華職業(yè)技術學院醫(yī)學院藥學部中藥專業(yè)施淑琴副教授鑒定為睡蓮科蓮屬植物蓮的成熟花托；原花青素對照品（純度≥98%，Lot160619）：上海盛中醫(yī)藥化工有限公司；纖維素酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；香草醛（20140726）、甲醇（20161017）、乙醇（20151218）、濃鹽酸（20150412）均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 對照品的制備

精密稱取原花青素對照品10.5 mg，置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，搖勻，得1.05 mg/mL的原花青素對照品貯備液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

采用閃式提取法[21]。將新鮮蓮蓬用干燥箱烘干，干品過40目篩，準確稱取該干蓮蓬粉10 g，放入錐形瓶中，加入纖維素酶，酶量為2%，加適量水，50℃酶解1 h，放入提取罐中，按一定的料液比加入提取溶劑，稱量，閃式提取一定時間，用提取液補足減少的重量，過濾，得蓮蓬提取液，精密移取該品1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，得供試品溶液。

2.3 原花青素標準曲線的繪制

精密移取貯備液，配置成濃度為0.0525、0.105、0.1575、0.210、0.315、0.630 mg/mL的系列對照品溶液。精密移取上述對照品溶液和空白對照（甲醇溶液）各1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入質量分數(shù)為3%香草醛-甲醇溶液3 mL和濃鹽酸溶液1.5 mL，搖勻，在25℃條件下避光顯色30 min，取出，用空白對照調零，使用紫外可見分光光度計在500 nm處測定吸光度值（A）。以A為縱坐標，以溶液濃度（C）為橫坐標，繪制原花青素標準曲線。得線性回歸方程：A = -0.1300+3.653C，線性范圍為0.0525～0.315 mg/mL，r = 0.9997，線性關系良好。

2.4 供試品中原花青素濃度測定和蓮蓬原花青素得率計算

供試品溶液按“2.3”項方法測定吸光度，并根據(jù)標準曲線的回歸方程計算供試品溶液中的原花青素濃度。得率計算公式如下：得率=提取液中原花青素質量/蓮蓬投料量×100%。

2.5 正交試驗

由于提取過程中各因素的相互作用會引起得率的變化，而單因素試驗不能反映各因素間的相互作用，因此，根據(jù)單因素試驗，選取對閃式提取工藝有影響的主要因素（乙醇體積分數(shù)A、提取時間B、料液比C），設計因素水平表，以蓮蓬中原花青素的得率為指標，采用L9（34）正交設計表優(yōu)化其閃式提取工藝。見表1。

2.6 各影響因素對蓮蓬中原花青素提取率的影響

2.6.1 乙醇體積分數(shù)的影響 取處理好的蓮蓬各10 g，分別加入體積分數(shù)為10%、20%、50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液200 mL，采用提取電壓70 V，提取時間2 min，提取次數(shù)1次的條件下，按前述“2.2”實驗方法進行實驗，計算蓮蓬中原花青素得率，重復試驗3次。結果顯示，蓮蓬中原花青素得率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而提高，當乙醇體積分數(shù)達到60%時，得率最高；繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)時，得率并未增加反而有所下降。故正交試驗選取乙醇體積分數(shù)為50%、60%和70%進行考察。

2.6.2 提取時間的影響 取處理好的蓮蓬各10 g，加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液200 mL進行閃提，提取電壓70 V，提取次數(shù)1次，提取時間分別為0.5、1、2、3、4、5 min，得提取液樣品。再按前述“2.3”實驗方法進行吸光度測定，并計算蓮蓬中原花青素得率，重復試驗3次。結果顯示，蓮蓬中原花青素得率隨著提取時間的增加而先提高后降低，在2 min和3 min時達到最高。隨著時間進一步延長降低的原因可能是連續(xù)高速機械攪拌和剪切，使得提取液局部溫度升高，導致一部分原花青素被氧化破壞。因此，正交試驗選取提取時間1、2、3 min進行考察。

2.6.3 液料比的影響 取處理好的蓮蓬各10 g，按料液比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液進行閃提，提取時間2 min，提取電壓70 V，提取次數(shù)1次，得提取液樣品。再按前述“2.3”實驗方法進行吸光度測定，并計算蓮蓬中原花青素得率，重復試驗3次。結果顯示，蓮蓬中原花青素得率隨料液比增加而提高，但當料液比達到20∶1時，得率趨向平行，也就是說料液比20∶1與70∶1未見顯著差異，故正交試驗選取料液比20∶1、30∶1和40∶1進行考察。

2.6.4 提取次數(shù)的影響 取處理好的蓮蓬各10 g，加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液200 mL，以提取時間2 min，提取電壓70 V，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次進行提取，合并提取液得各提取液樣品。再按前述“2.3”實驗方法進行吸光度測定，并計算蓮蓬中原花青素得率，重復試驗3次。結果顯示，蓮蓬中原花青素得率2次提取比1次有所增加，但再增加提取次數(shù)如3、4次時并未隨著提取次數(shù)的增加有顯著提高，幾乎呈直線狀，這可能與紫外分光光度法的測量誤差有關。但乙醇溶劑消耗成倍數(shù)增長，且濃縮純化耗時較多，故為了節(jié)約時間及能源，正交試驗中提取次數(shù)統(tǒng)一為1次。

2.7 正交實驗結果

根據(jù)單因素試驗結果設計的表1進行試驗，實驗結果進行數(shù)據(jù)分析得各水平平均值（均值1、2、3）及各因素的極差，見表2。由表2可知，閃式提取工藝各因素對蓮蓬中原花青素得率影響的程度依次為A>B>C，即乙醇體積分數(shù)>提取時間>料液比，乙醇體積分數(shù)（A）對蓮蓬中原花青素得率影響最大，3個因素對蓮蓬中原花青素的閃式提取得率的最佳工藝條件為A2B3C3，即用60%體積分數(shù)的乙醇，按40倍的液料比閃式提取3 min。對正交試驗結果的3個因素進行顯著性檢驗，結果見表3。由表3可知，酶解閃式提取蓮蓬中原花青素的正交試驗中，乙醇體積分數(shù)對原花青素的提取率達到極顯著水平，另外提取時間和料液比2個因素的影響為顯著。根據(jù)正交實驗優(yōu)化所得的工藝組合（A2B3C3）進行3次平行驗證實驗，其平均得率為8.12%。

3 討論

通過單因素實驗選取適當?shù)乃椒秶M行酶輔助閃式提取蓮蓬原花青素的正交實驗，以優(yōu)化提取工藝，獲得最優(yōu)工藝條件是：乙醇體積分數(shù)60%，液料比40∶1，閃式提取時間3 min，其中各因素的影響順序是乙醇體積分數(shù)>提取時間>料液比。采用此工藝條件實驗，蓮蓬原花青素的平均得率為8.12%。與周蕓[22]實驗中采用傳統(tǒng)的單純水蒸氣蒸餾法提取的得率（5.89%～6.19%）和乙醇回流提取的得率（6.65%～7.26%）比較，在沒有降低原花青素提取得率的情況下，縮短了提取時間（回流提取法1次2 h，一般需提取2次），而閃式提取法只需要1～3 min，能提高提取效率。酶解閃式提取法提取蓮蓬中的原花青素可獲得較好效果。這是因為酶解閃式提取法是在傳統(tǒng)溶劑法提取的基礎上，根據(jù)植物細胞壁的構成，利用酶的反應所具有的高度專一性特點，選擇相應的酶，將細胞壁的組成成分降解或水解，破壞細胞壁結構，使構成植物細胞壁等不易利用的植物纖維分解成葡萄糖，從而有利于有效成分從植物中溶出，本實驗將再通過閃式提取技術，即依靠高速機械剪刀力和超動分子滲透，在常溫及溶劑存在下幾秒鐘內把蓮蓬破碎至細微顆粒，使原花青素快速的被乙醇分子包圍、解離、替代，最后脫離蓮蓬進入溶劑中，原花青素迅速達到組織內外平衡，從而實現(xiàn)快速、高效、高得率的提取目的。本實驗結果可為酶輔助閃式提取的大規(guī)模工業(yè)應用提供參考和依據(jù)。酶解閃式法需要專門的設備-閃式提取器，這是一種新型的提取設備，適用于中草藥葉、花、根、莖、果實等的提取，既可用于單味中藥提取，又可用于復方中藥提取，具有提取時間短、可避免有效成分受熱破壞的等優(yōu)點。但需注意的是，由于沒有類似儀器設備的操作經驗參考，使用時如操作不當，不僅達不到預期的提取效果還可能損壞設備。

[參考文獻]

[1] 陳衛(wèi)航，譚美亭，張婕.響應曲面法優(yōu)化蓮房原花青素提取工藝研究[J].鄭州大學學報：工學版，2012，33（2）：31-35.

[2] 張曉玲，周蕓，熊小鳳，等.荷葉中荷葉堿及原花青素提取工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2012，33（23）：295-298.

[3] 陳超群，吳春艷.蓮房中原花青素的藥理作用研究進展[J].中成藥，2014，36（8）：1734-1738.

[4] 趙小亮，章軍.蓮不同藥用部位化學成分研究綜述[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（1）：106-109.

[5] 張志誠.蓮天然產物及其生物活性研究進展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（8）：402-405.

[6] 童錫迪，彭紅，王瓊，等.HPLC法測定蓮子殼提取物中原花青素的含量[J].食品科學，2015，36（2）：145-148.

[7] Falleh H，Oueslati S，Guyot S，et al. LC/ESI-MS/MS characterisation of procyanidins and propelargonidins responsible for the strong antioxidant activity of the edible halophyte Mesembryanthemum edule L [J]. Food Chem，2011， 127（4）：1732-1738.

[8] 梁華正，劉成佐.太空蓮葉原花青素的提取及分離純化[J].食品科技，2014，39（1）：198-203.

[9] 盧律達，黃義，郭曉蘭，等.原花青素對腎血管性高血壓大鼠血壓及血清抗氧化能力的影響[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2012，32（20）：1631-1633.

[10] Del Bas JM，F(xiàn)ernández-Larrea J，Blay M，et al. Grape seed procyanidins improve atherosclerotic risk index and induce liver CYP7A1 and SHP expression in healthy rats [J]. J Express Article，2005，19（3）：479-481.

[11] 齊玲，鐘越，任曠，等.越桔原花青素抑制膠質瘤細胞生長作用[J].中國公共衛(wèi)生，2016，3（32）：315-317.

[12] 胡濟美，李倬林，岳玉蘭，等.刺玫籽油及原花青素降血脂作用[J].食品科學，2017，13（38）：213-218.

[13] 李智平，韓利文，何秋霞，等.原花青素對特非那定誘導的斑馬魚心臟損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床，2017， 3（33）：54-57.

[14] 劉丹，王高頻，常清華，等.原花青素對缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關基因蛋白表達的影響[J].中國循環(huán)雜志，2016，7（31）：696-700.

[15] 王鑫，王巍，張君丞，等.原花青素通過內質網應對H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用[J].中國醫(yī)藥導報，2016，32（13）：29-33.

[16] 李新瑩，姚舜.響應面法優(yōu)化甘蔗梢提取物中花青素的分離工藝[J].食品科學，2015，36（2）：7-11.

[17] 汪志慧，孫智達，謝筆鈞.響應曲面法優(yōu)化雙酶法提取蓮房原花青素[J].食品科學，2011，32（4）：64-68.

[18] 容晨曦，張秀玲，李鐵柱，等.響應面試驗優(yōu)化微波法提取刺玫籽原花青素的工藝[J].食品科學，2016，37（18）：41-46.

[19] 彭芳剛，李綺麗，吳衛(wèi)國.響應面法優(yōu)化紅蓮外皮原花青素的提取工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013，26（9）：1349-1354.

[20] 呂玉姣，曹清麗，林強.原花青素提取、分離純化方法研究進展[J].化學世界，2014（10）：628-640.

[21] 陳菲，盛柳青，麻佳蕾.松針中原花青素的閃式提取及其抗氧化活性[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2014，45（2）：120-123.

[22] 周蕓.蓮房原花青素制備工藝及抗氧化活性研究[D].杭州：浙江大學，2012.

（收稿日期：2017-11-24 本文編輯：張瑜杰）