耐鹽促生菌株B7的篩選及其在黃瓜上的應(yīng)用

錢蘭華 李婧 王桃云

摘要 本文綜述了一種提高作物耐鹽能力促生菌的篩選及其應(yīng)用。通過對沿海灘涂鹽堿地土壤中的微生物進(jìn)行分離純化，并采用耐鹽和解鹽試驗(yàn)對分離純化出的根際微生物進(jìn)行耐鹽促生篩選，得到高耐鹽活性促生菌B7。對B7的16S rDNA、生理生化性質(zhì)及促生能力進(jìn)行測定，最后采用培養(yǎng)皿法和盆栽法對B7提高黃瓜耐鹽能力進(jìn)行測試。結(jié)果表明，該菌株耐鹽度為6%，利用B7制備的微生物菌劑能在鹽脅迫下顯著提高黃瓜的耐鹽能力，減緩鹽害現(xiàn)象，增加生物量，達(dá)到促進(jìn)黃瓜生長的效果。

關(guān)鍵詞 促生菌；耐鹽能力；耐鹽菌株B7；黃瓜

中圖分類號 S156.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）19-0122-03

隨著社會的發(fā)展和人口的增加，人們對耕地資源的需求也越來越多。土壤鹽漬化是指土壤底層或地下水的鹽分隨毛管水上升到地表，水分蒸發(fā)后，使鹽分積累在表層土壤中的過程；易溶性鹽分在土壤表層積累的現(xiàn)象或過程，也稱鹽漬化。除濱海地區(qū)由于受海水浸漬影響而發(fā)生鹽堿化外，干旱和半干旱地區(qū)發(fā)展設(shè)施農(nóng)業(yè)也是引起土壤次生鹽漬化的重要原因[1-2]。土壤鹽漬化是當(dāng)前威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因子之一。目前，全球有50%的灌溉土地受到不同程度的鹽脅迫，中國鹽漬土（或稱鹽堿土）的分布范圍廣、面積大、類型多，總面積約1億hm2，而且威脅面積逐年增加。如何改良和利用大面積鹽漬化土地，以及保護(hù)并提高重要經(jīng)濟(jì)作物抵抗鹽脅迫的能力是當(dāng)今國際社會亟待解決的重要科技問題[3-5]。目前，主要生物改良方法有培育并種植耐鹽堿作物，如種植高粱、甜菜、向日葵以及耐鹽植物檉柳、沙蓬草、紫穗槐等；此外，還有對耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的研究，但該類方法周期長、花費(fèi)大，且未被社會廣泛接受和認(rèn)可。

根際微生物是指在植物根系土壤范圍內(nèi)生長繁殖的細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物。大多數(shù)根際微生物對植物無害或?qū)χ参锷L有促進(jìn)作用，部分微生物還具有固氮、溶磷、產(chǎn)生植物生長激素和鐵載體以及誘導(dǎo)植物抗性的功能。利用根際微生物提高鹽堿地作物耐鹽促生的方法具有投資少、見效快、效益高等特點(diǎn)。因此，有關(guān)根際微生物耐鹽促生的功能活性研究已經(jīng)受到研究者的廣泛關(guān)注。從沿海灘涂土壤中分離篩選耐鹽性菌株，可用于提高作物耐鹽能力，同時可為耐鹽基因的克隆及轉(zhuǎn)基因耐鹽植物的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。本文綜述了耐鹽性促生菌株B7在鹽脅迫中促進(jìn)作物發(fā)芽和生長的應(yīng)用及其微生物菌劑制備方法，以期為耐鹽性促生菌株B7的應(yīng)用研究提供參考。

1 土壤芽孢桿菌菌株B7

1.1 耐鹽菌株的分離及篩選

2017年7月6日，從江蘇鹽城沿海灘涂的鹽堿地土壤采集土樣15份，各取土樣1 g懸浮于100 mL無菌水中，并以此稀釋至105倍。采用LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，利用NaCl濃度為2%、4%、6%、8%、10%的NA培養(yǎng)基逐級篩選耐鹽菌株。用移液器分別取土壤稀釋液0.1 mL涂布于2種培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，選取在6%鹽濃度下生長良好的菌落，經(jīng)反復(fù)劃線純化后保存?zhèn)溆茫Y選得到1株耐鹽菌株B7。耐鹽促生菌株B7具有耐鹽促生活性，最適生長溫度為30 ℃，菌落較小、白色、隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤、不透明，為好氧型化能異養(yǎng)菌。菌株B7的平板培養(yǎng)菌落如圖1所示。

1.2 耐鹽菌株B7的鑒定

1.2.1 細(xì)菌分子遺傳學(xué)分類鑒定。以菌株B7的DNA為模板、16S rDNA通用引物為引物，對16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增的片段直接進(jìn)行序列測定。將測序的結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，該菌株的16S rDNA序列與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬Bacillus meg-aterium的16S rDNA序列同源度最高，同源率達(dá)到100%。通過DNAMAN6.0對GenBank中已有的芽孢桿菌屬的16S rDNA序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，菌株B7的16S rDNA與Bacillus megaterium同源性最高。因此，可以初步判定該菌株為芽孢桿菌屬的巨大芽孢桿菌。

1.2.2 生理生化測定。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對耐鹽菌株進(jìn)行生理生化測定，初步鑒定為革蘭氏陽性，吲哚反應(yīng)陽性，能水解淀粉和葡萄糖，能液化明膠；伏-普試驗(yàn)反應(yīng)陰性、甲基紅反應(yīng)陰性，硫化氫陰性，檸檬酸鹽試驗(yàn)陰性。

根據(jù)上述對該菌株遺傳特性和生理生化特性的測定結(jié)果，確定從鹽堿地土壤中篩選到的耐鹽性促生菌株B7為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

1.3 耐鹽菌株B7的耐鹽性分析

將分離純化的耐鹽菌株B7菌懸液，分別轉(zhuǎn)接相同量到不同鹽濃度的液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、130 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，觀察生長情況，24 h后測其在600 nm波長處的吸光值，以確定細(xì)菌耐鹽程度。耐鹽性結(jié)果如圖2所示，可見耐鹽菌株B7對氯化鈉有較寬的適應(yīng)范圍，菌株在無鹽情況下不發(fā)生自溶現(xiàn)象，在鹽濃度達(dá)到6%情況下仍然可保持較高的菌體濃度，在0～6%的鹽濃度下均可生長，最適鹽濃度為4%～6%。

2 菌株應(yīng)用試驗(yàn)

2.1 菌株菌懸液制備方法

挑取在LB固體平板生長48 h的耐鹽菌株B7單菌落，接種于250 mL LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、130 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h后，待菌體生長至對數(shù)生長期，放入無菌離心管中12 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，用無菌水洗滌菌體2次后，再用無菌水調(diào)節(jié)菌體的吸光值為0.5～0.6，作為生物菌劑。

2.2 黃瓜種子培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗(yàn)

取適量未經(jīng)處理的黃瓜種子放入燒杯中進(jìn)行消毒滅菌，先用75%乙醇（沒過種子）浸泡1 min，然后倒出乙醇溶液，再加入現(xiàn)配的0.1%氯化汞浸泡1 min，然后倒出氯化汞溶液，最后用無菌水清洗3次，備用。準(zhǔn)備適量的培養(yǎng)皿，將脫脂棉平鋪在培養(yǎng)皿底層，蓋好后滅菌待用；配制200 mmol/L氯化鈉溶液，滅菌后備用。試驗(yàn)設(shè)4個處理，分別為空白對照組、耐鹽菌株組、鹽脅迫組和鹽脅迫+耐鹽菌株組。其中，鹽脅迫組、鹽脅迫+耐鹽菌株組加200 mmol/L NaCl溶液（沒過脫脂棉），空白對照組和耐鹽菌株組加蒸餾水，3次重復(fù)。每個培養(yǎng)皿中放入40個種子（空白對照組和鹽脅迫組的種子用無菌水浸泡6 h，耐鹽菌株組和鹽脅迫+耐鹽菌株組的種子用B7菌液浸泡6 h）。將上述已完成所有步驟的培養(yǎng)皿放入光照培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)7 d（前3 d暗培養(yǎng)，后4 d 為12 h光照培養(yǎng)、12 h暗培養(yǎng)）。

試驗(yàn)結(jié)束后，記錄黃瓜種子發(fā)芽率、鮮重和干重。試驗(yàn)結(jié)果如圖3、表1所示。結(jié)果表明，耐鹽菌株B7+鹽脅迫處理組的種子發(fā)芽率、鮮重分別是鹽脅迫組的1.25倍和1.23倍，說明耐鹽菌株B7對黃瓜種子具有明顯的耐鹽促生作用。

2.3 黃瓜盆栽試驗(yàn)

將黃瓜種子用溫水浸泡過夜后，先用75%乙醇（沒過種子）浸泡1 min后倒出，再加入現(xiàn)配的0.1%氯化汞浸泡1 min后倒出，最后用已滅過菌的蒸餾水清洗3次，備用。用營養(yǎng)土與蛭石（體積比4∶1）混合配制盆栽基質(zhì)，121 ℃滅菌1 h，冷卻后裝至栽培盆（10 cm×10 cm×10 cm）中，每盆裝入200 g。分別設(shè)置空白對照（無鹽脅迫）、鹽脅迫和鹽脅迫+B7菌株3個處理，其中鹽脅迫+B7菌株處理的種子先用菌株B7菌液浸泡6 h、空白對照和鹽脅迫處理的種子用滅菌水浸泡6 h，5次重復(fù)。每盆播入處理好的黃瓜種子3粒，然后空白組用無菌水澆灌、鹽脅迫組和鹽脅迫+B7菌株組用菌株B7菌液混合200 mmol/L NaCl溶液澆灌，每周澆灌1次，其余時間澆灌無菌水。出苗后，計(jì)算發(fā)芽率和出苗率；然后每盆保留1株幼苗，1個月后測定總根長、總投影面積、總根表面積、平均根系直徑和根尖數(shù)等生長指標(biāo)及葡萄糖、賴氨酸含量等生理指標(biāo)（表2、3）。

3 植物耐鹽促生劑的制備

挑取已在LB固體平板上生長48 h的耐鹽菌株B7單菌落，接種于250 mL LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、130 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h，待菌體生長至對數(shù)生長期，放入無菌離心管中12 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，用無菌水洗滌菌體2次后，無菌水調(diào)節(jié)菌體的吸光值為0.6，即得植物耐鹽促生劑。

4 結(jié)語

本文綜述了耐鹽性促生菌株B7的分離、篩選、鑒定及耐鹽性分析，通過遺傳特性和生理生化特性測定，確定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；通過耐鹽度分析、鹽脅迫條件下的黃瓜種子發(fā)芽及盆栽試驗(yàn)中對黃瓜的耐鹽促生作用分析，表明該菌株耐鹽度為6%，同時發(fā)現(xiàn)利用耐鹽菌株B7制備的微生物菌劑能在鹽脅迫下顯著提高黃瓜耐鹽能力，減緩鹽害現(xiàn)象，增加生物量，達(dá)到促進(jìn)黃瓜生長的效果，有助于提高黃瓜的耐鹽性，減少化學(xué)肥料的使用。因此，該菌劑具有廣泛的應(yīng)用前景。

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