皮膚鱗狀細胞癌細胞中BAG-1表達變化對細胞增殖、凋亡的影響及機制

張佳音,鐘咪,饒美榮,曾芬

(無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫214041)

皮膚鱗狀細胞癌(CSCC)是第二種最常見的非黑色素瘤皮膚癌，為老年人中常見的惡性腫瘤。近年由于人口老齡化和紫外線照射增加，其發(fā)病率不斷上升[1]。CSCC患者手術(shù)預后較好，但是其早期較易被忽視，而晚期CSCC患者腫瘤浸潤較深，常伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增加了手術(shù)難度，預后較差[2，3]。目前，CSCC發(fā)生發(fā)展的確切分子機制仍然未知，且尚未有針對CSCC治療的標準靶向治療藥物及靶點[4]。因此，研究CSCC發(fā)生發(fā)展的分子機制，進一步尋找CSCC新型生物標志物和治療靶點，對于提高晚期CSCC患者生存率和改善生存質(zhì)量具有重要意義。BAG-1是近年Cutress等[5]發(fā)現(xiàn)的與Bcl-2蛋白結(jié)合的一種新抗凋亡基因，其可以通過與多種細胞靶蛋白相互作用發(fā)揮抗凋亡作用，而且通過調(diào)控多種信號通路參與細胞的轉(zhuǎn)錄、增殖、遷移[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因1(BAG-1)在正常組織中不表達或低表達，而在食管癌、胃癌等多種腫瘤中高表達，并且其高表達與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8,9]。皮膚黑色素瘤中BAG-1高表達，可促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[10]，但是BAG-1在CSCC中的表達情況及其對細胞增殖和凋亡的影響未見報道。2016年10月～2017年12月，本研究以CSCC細胞株A431以及人正常永生化上皮細胞Hecate為研究對象，旨在研究BAG-1在CSCC細胞系增殖和凋亡中發(fā)揮的作用及機制，為發(fā)現(xiàn)CSCC基因治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人CSCC細胞系A(chǔ)431和人正常永生化上皮細胞Hecate均購自美國ATCC細胞庫。細胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2全濕度培養(yǎng)箱中，A431培養(yǎng)基為10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640，Hecate培養(yǎng)基為10% FBS的DMEM-高糖。DMEM-高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、FBS購自美國Gibco公司，MTS細胞增殖檢測、細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、蛋白裂解試劑購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒等均購自日本TaKaRa公司。BAG-1、內(nèi)參GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成，TRIzol購自美國Invitrogen公司，兔抗人BAG-1抗體(ab32109)、兔抗人E3泛素連接酶鼠雙微基因2(Mdm-2)抗體(ab170880)、鼠抗人p53抗體(ab26)、鼠抗人Bax抗體(ab32503)、鼠抗人p21抗體(ab109520)、鼠抗人GAPDH抗體(ab8245)及BCA試劑盒購自美國Thermo公司。BAG-1敲減病毒由上海吉凱基因公司包裝合成。

1.2 分組及處理 人CSCC細胞系A(chǔ)431細胞呈對數(shù)生長期時將細胞鋪至六孔板，貼壁24 h后，按說明書將Ploybree與無有效序列的慢病毒空載體(對照組)及BAG-1抑制慢病毒載體(抑制組)感染至細胞中，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12～16 h更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 細胞中BAG-1 mRNA表達的檢測 采用qRT-PCR法。采用TRIzol法裂解細胞提取總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進行熒光定量PCR。引物序列:BAG-1: F:5′TGAGAAGCACGACCTTCATGT3′, R: 5′GGAACCCCTATGACCTCTTCA3′;GAPDH:F: 5′ GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT3′, R: 5′GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG3′。以GAPDH為內(nèi)參基因。每個樣品設(shè)置3個反應(yīng)復孔，按兩步法進行反應(yīng)，94 ℃變性，65 ℃左右退火與延伸，分析各樣品的循環(huán)閾值(Ct)，用2-ΔΔCt法分析各組實驗數(shù)據(jù)。重復實驗3次。

1.4 細胞增殖活力的檢測 采用MTS法。感染病毒72 h后的各組細胞以每孔1 500個細胞、150 μL培養(yǎng)基接種于96孔板中，每組設(shè)6個平行復孔，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在鋪板后第0、1、2、3、4天，各孔加入MTS工作液30 μL，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，掃描酶標儀490 nm波長處測吸光度(OD值)。

1.5 細胞克隆形成能力的檢測 采用細胞克隆增殖試驗。收集感染病毒72 h后的各組細胞以每孔200個細胞、2 mL培養(yǎng)基接種于6孔板中，每組設(shè)3個平行復孔，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2周左右，肉眼觀察到克隆團時，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，甲醇固定15 min，晾干后加入蘇木素1 mL染色30 min，雙蒸水沖洗后晾干，掃描拍照，計數(shù)肉眼可見克隆團。

1.6 細胞周期的檢測 采用流式細胞術(shù)。收集感染病毒72 h后的各組細胞，每管6×105個細胞，PBS洗3次后，70%乙醇固定24 h，PBS洗2次后，加入PI染色工作液500 μL(PI儲存液12.5 μL，RNase儲存液5 μL，緩沖液482.5 μL)，混勻后37 ℃溫箱中避光孵育30 min。PBS洗1次后，流式細胞儀檢測分析各周期細胞數(shù)。重復實驗3次。

1.7 細胞凋亡率的測算 采用流式細胞術(shù)。用無EDTA的胰酶收集感染病毒72 h后的各組細胞，每管1×106個細胞，PBS洗3次后，加入染色工作液500 μL(Binding Buffer 490 μL， PI 5 μL，F(xiàn)ITC 5 μL)，混勻后避光室溫孵育15 min。PBS洗1次后，流式細胞儀檢測分析凋亡細胞百分數(shù)。重復實驗3次。

1.8 細胞BAG-1、Mdm-2、p53、Bax和p21蛋白的檢測 采用Western blotting法。感染病毒72 h后的各組細胞，每孔加入蛋白裂解液500 μL(蛋白酶抑制劑5 μL和磷酸酶抑制劑5 μL)，超聲裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，BCA試劑盒測蛋白濃度，煮沸變性后，每孔50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，8%脫脂牛奶封閉2 h，加入Mdm-2、p53、Bax和p21 一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后，二抗孵育室溫孵育1.5 h，ELC化學發(fā)光法曝光條帶，掃描拍照。蛋白條帶灰度值采用Quantity One V4軟件進行分析。結(jié)果重復3次。

2 結(jié)果

2.1 細胞中BAG-1的表達比較 A431細胞、Hecate細胞中BAG-1 mRNA相對表達量分別為13.10±0.24、1.00±0.10，BAG-1蛋白相對表達量分別為8.54±1.13、1.00±0.10。A431細胞BAG-1 mRNA及蛋白相對表達量均高于Hecate細胞(P均<0.05)。抑制組A431細胞中BAG-1的相對表達量(mRNA 0.24±0.04,蛋白0.36±0.04)低于對照組(mRNA 1.00±0.10,蛋白1.00±0.10)(P均<0.05)。

2.2 各組細胞增殖活力的比較 與對照組相比，抑制組細胞增殖活力降低(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組不同時間細胞增殖活力比較

2.3 各組細胞克隆形成能力的比較 抑制組細胞細胞克隆團數(shù)目[(62.02±12.58)個]高于對照組[(263.11±15.28)個](t=12.410，P=0.028)。

2.4 各組不同細胞周期分布及細胞凋亡率比較 兩組細胞周期分布比較差異有統(tǒng)計學意義(F=15.24，P=0.013)。與對照組比較，抑制組G1期細胞百分比高，S期及G2期細胞百分比低(P均<0.05)，細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組不同細胞周期細胞分布及細胞凋亡率比較

2.5 各組Mdm-2、p53、Bax和p21蛋白表達水平比較 與對照組相比，抑制組p53、p21和Bax蛋白表達增加，Mdm-2蛋白表達減少(P均<0.05)。見表3。

表3 各組Mdm-2、p53、Bax、p21蛋白相對表達量比較

3 討論

CSCC好發(fā)于頭面部等被紫外線照射的部位，不僅影響美觀，還嚴重威脅其生命健康[11]。CSCC具有高侵襲性和遠處轉(zhuǎn)移的特性，使得標準化療和放療對晚期患者的療效有限，因此一些學者開始研究CSCC的基因組背景，尋找新的治療CSCC的可行靶標[12]。BAG-1基因位于染色體9p12，其編碼的BAG-1蛋白屬于抗凋亡蛋白家族成員，為一種多功能蛋白，通過蛋白與蛋白相互作用的方式與核受體激素、絲氨酸/蘇氨酸激酶等多種靶分子結(jié)合，影響靶分子的功能[13，14]。研究證實，BAG-1在正常組織中多不表達，其表達多在腫瘤中。劉鋼[15]研究發(fā)現(xiàn)，BAG-1不僅在甲狀腺癌組織中的表達高于癌旁組織，并且其高表達與腫瘤分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高臨床分期有關(guān)。在結(jié)直腸癌中，BAG-1高表達可作為判斷腫瘤預后的一個獨立危險因素；其在伯基特淋巴瘤細胞中高表達，促進細胞增殖，而在CSCC中的研究未見報道，因此我們以CSCC細胞株A431為工具細胞，以期研究BAG-1在CSCC細胞系中的表達情況，以及是否具有生物學功能。

qRT-PCR、Western blotting法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BAG-1在CSCC細胞系A(chǔ)431中相對表達量高于人正常永生化上皮細胞Hecate，提示BAG-1在CSCC中高表達，可能為CSCC的候選癌基因。進一步我們采用基因敲減效率較高的敲減病毒感染細胞技術(shù)，抑制A431細胞中BAG-1基因的表達后，MTS檢測細胞活力下降、平板克隆檢測細胞克隆形成能力減弱，提示細胞增殖受到抑制。BAG-1為具有促進細胞增殖的驅(qū)動基因，細胞周期紊亂和失控會導致細胞異常增殖，進而導致腫瘤發(fā)生，CSCC也不例外，由此我們采用流式細胞儀檢測BAG-1對CSCC細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)抑制BAG-1后，G1期細胞增多，與Enthammer等[10]研究結(jié)果類似，即干擾BAG-1的表達，可通過將黑色瘤細胞阻滯在S期而抑制細胞的增殖。BAG-1是凋亡相關(guān)基因。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BAG-1在順鉑誘導的肺腺癌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，本研究中我們同樣檢測了BAG-1對CSCC細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示抑制BAG-1的表達后細胞凋亡增多，表明BAG-1對CSCC細胞周期增殖和凋亡均有作用。

明確了BAG-1在CSCC細胞中發(fā)揮的具體生物學效應(yīng)，我們進一步研究其作用的機制。p53基因是較早發(fā)現(xiàn)的最重要抑癌基因之一，與細胞周期的調(diào)控、細胞凋亡、細胞分化等生物學功能密切相關(guān)。在正常生命活動中細胞內(nèi)的p53蛋白含量較少，當細胞受到外界刺激存在DNA損傷時，應(yīng)激信號會觸發(fā)細胞的p53蛋白含量增多，引發(fā)下游信號一系列變化，與細胞周期調(diào)控通路有關(guān)的p53/p21會使細胞阻滯在S期，進行DNA損傷的修復，以維持細胞正常周期進行，如DNA損傷修復失敗，則啟動與凋亡有關(guān)調(diào)控通路；p53/Bax促進異常細胞的凋亡，而原癌基因激活或有害因素持續(xù)刺激時，細胞內(nèi)p53蛋白含量調(diào)節(jié)失控，不能發(fā)揮其正常生理作用而導致細胞周期紊亂、細胞凋亡異常。本研究結(jié)果顯示抑制BAG-1表達后，細胞中p53、p21、Bax蛋白表達增多，表明BAG-1通過p53信號通路調(diào)節(jié)CSCC細胞增殖與凋亡。研究報道，p53主要被Mdm-2調(diào)節(jié)，Mdm-2可通過泛素化降解p53蛋白量和直接抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性。同時Mdm-2與p53結(jié)合形成一個精密的負反饋調(diào)節(jié)環(huán)，即其與p53形成p53-Mdm-2復合物，抑制p53介導的抑癌作用，而p53則能促進Mdm-2蛋白合成，參與細胞周期調(diào)控、細胞生長及凋亡等過程。本研究中抑制BAG-1的表達，Mdm-2表達減少，p53蛋白表達增多，表明BAG-1調(diào)控Mdm-2是p53介導的CSCC細胞增殖和凋亡的關(guān)鍵基因。

綜上所述，BAG-1在CSCC細胞中高表達，通過調(diào)控Mdm-2/p53信號通路促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，本研究為CSCC發(fā)生分子機制研究提出新的實驗室依據(jù)，為CSCC的防治提供了新的干預靶點。