副溶血弧菌TDH對大黃魚的免疫保護(hù)效果

張賽樂 閆茂倉 王瑤華 陳然 （浙江海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江 溫州 325005）

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副溶血弧菌TDH對大黃魚的免疫保護(hù)效果

張賽樂 閆茂倉*王瑤華 陳然 （浙江海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江 溫州 325005）

本試驗(yàn)以大黃魚為研究對象，探討副溶血弧菌TDH對其免疫保護(hù)效果。設(shè)VPtdh注射免疫處理組和PBS注射對照組，每組做3個重復(fù)。免疫處理組每尾魚腹腔注射0.1ml接種2mg/ml VPtdh，對照組注射相同劑量的滅菌生理鹽水，每組魚接種100尾。試驗(yàn)前和免疫注射第7、14、21和28天，測定抗體水平和相對免疫保護(hù)率。結(jié)果表明，接種VPtdh后抗體水平較對照組有顯著提高，在21d達(dá)到峰值；免疫28d后，相對免疫保護(hù)率達(dá)70.4%。證實(shí)副溶血弧菌TDH對大黃魚有較好的免疫保護(hù)效果。

大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國重要的網(wǎng)箱養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一，目前日益嚴(yán)重的病害阻礙了大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，其中尤以弧菌(Vibrio sp.)引起的敗血癥和腸炎等對規(guī)模化養(yǎng)殖構(gòu)成較大威脅，弧菌病具有發(fā)病率高、稚魚死亡率高、發(fā)病季節(jié)長、傳播速度快等特點(diǎn)，主要致病弧菌包括副溶血弧菌(V. Parahaemolyticus)、哈氏弧菌(V. harveyi)、鰻弧菌(V. anguillarum)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)[1-3]。其中，副溶血弧菌是目前在海水魚類養(yǎng)殖中有極大危害的病原弧菌之一，業(yè)已證實(shí)，副溶血弧菌可感染大黃魚，感染后表現(xiàn)為腸道炎癥，皮膚潰爛，爛尾，眼球、下領(lǐng)、鰭基部、肌肉充血等癥狀[3-6]。副溶血弧菌具有很多毒力因子參與其致病過程，包括溶血素、黏附因子、各種酶以及細(xì)菌分泌系統(tǒng)等。其中耐熱直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)與副溶血弧菌致病性密切相關(guān)，是公認(rèn)的主要毒力因子，具有溶血性、細(xì)胞毒性和腸毒性[7-9]。同時，TDH也具有較好免疫原性和免疫效果。本研究擬進(jìn)行大黃魚副溶血弧菌tdh基因的克隆表達(dá)，制備TDH蛋白，免疫接種評價副溶血弧菌VPtdh對大黃魚的免疫保護(hù)效果，為大黃魚副溶血弧菌的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試魚 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所自繁養(yǎng)殖大黃魚，體重(41.3±3.71)g；選擇規(guī)格一致、外觀健壯、游動活潑、無外傷的魚作為試驗(yàn)魚。試驗(yàn)魚暫養(yǎng)于5m×8m×1.0m的室內(nèi)水泥池中，充氣，以配合餌料(福州海馬飼料有限公司)每日早、晚各投餌1次，每天上午換水70%，流水3h，水溫控制在27.8~31.2℃。暫養(yǎng)2周后，進(jìn)行免疫接種。

1.2 菌株 副溶血弧菌大黃魚分離株，由本實(shí)驗(yàn)室從樂清灣患病養(yǎng)殖黃魚中分離保存。Rosetta(DE3)菌株購自上海生物工程有限公司。

1.3 副溶血弧菌TDH蛋白的制備

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank副溶血弧菌tdh基因的DNA序列，應(yīng)用Premier5.0軟件設(shè)計引物：F：5’-GCGG ATCCATGAAACACCAATATTTTGC-3’(含BamHI酶切位點(diǎn))；R：5’-CGGAATTCTTATTTTTATTGTTGATGT-3’(含EcoRI酶切位點(diǎn))。

1.3.2 PCR檢測 提取大黃魚副溶血弧菌基因組DNA，PCR擴(kuò)增tdh基因片段。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，重復(fù)35個循環(huán)，72℃保持10min。產(chǎn)物用1g/d·L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3.3 重組pET28b-TDH質(zhì)粒構(gòu)建 將載體pET-28b分用限制性內(nèi)切酶(BamHI 和EcoRI)進(jìn)行酶切，用T4-DNA連接酶與目的片段在16 ℃過夜連接。

1.3.4 誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白 取1μl重組的pET28b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)菌株，42℃熱擊90s，冰上靜置2min后涂平板(30μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素)，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。擴(kuò)大培養(yǎng)接種于4L的LB液體培養(yǎng)基中，添加30μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素，37℃，220rpm培養(yǎng)約3h，當(dāng)OD值達(dá)到0.6左右時，添加終濃度為0.5mM IPTG，20℃，220rpm，誘導(dǎo)過夜，離心收集細(xì)胞菌體。將收集的細(xì)菌菌體用破碎溶解，冰浴中超聲破碎菌體，12000rpm，4℃，離心20min，上清進(jìn)行鎳瓊脂糖親和層析，將收集到的組分進(jìn)行SDS-PAGE檢測后，將純度最好的組分透析至1XPBS，pH7.4中，0.45μm濾膜過濾濃縮分裝，-80℃保存。

1.3.5 純化蛋白的檢測 SDS-PAGE和Western blot檢測目的蛋白，采用SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。調(diào)整使用濃度為2 mg/ml備用。

1.4 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)在3.3m×3.3m×1.0m的水泥池中進(jìn)行。設(shè)VPtdh注射免疫處理組和PBS注射對照組。每組做3個重復(fù)。免疫處理組每尾魚腹腔注射0.1ml接種2mg/ml VPtdh，對照組注射相同劑量的滅菌生理鹽水，每組魚接種100尾。試驗(yàn)前和免疫注射第7、14、21和28d后，分別從每組中隨機(jī)撈取5尾魚尾靜脈采血，制備血清，供檢測抗體水平。

1.5 抗體水平的測定

采用間接ELISA的方法測定血清中抗體水平，一抗為待測血清(即-20℃冷凍保存的樣品)，二抗為實(shí)驗(yàn)室自制的兔抗大黃魚IgM多克隆抗體，三抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(SIGMA)?？乖瓭舛?×108cfu/ml，包被4℃過夜；酶標(biāo)抗體濃度為1:20000；底物作用20min后，終止液終止，測OD450值。

1.6 免疫保護(hù)率測定

采用Reed and Muench(1938)的方法測定副溶血弧菌對大黃魚的LD50分別為5.2×105cells/魚。于免疫接種后的第28 d，從免疫處理組和對照組各取30尾大黃魚，每組各設(shè)3個平行組，每個平行組10尾魚，每尾魚腹腔注射0.1ml濃度為5.2×106CFU/ml副溶血弧菌活菌液。置于二級沙濾水飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14d，記錄死亡狀況，并進(jìn)行解剖和病原的再分離以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。試驗(yàn)結(jié)束后計算相對免疫保護(hù)率：

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用STATISTICA.0統(tǒng)計軟件作單因素方差分析處理，組間差異采用Duncan’s多重比較，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌TDH蛋白的制備

SDS-PAGE分析結(jié)果提示，基因重組的TDH蛋白表達(dá)成功。經(jīng)檢測在23KD處出現(xiàn)重組蛋白條帶與目的條帶相符。經(jīng)不同濃度咪唑洗脫后，洗脫液中含有目的蛋白(圖1)。融合蛋白經(jīng)過純化，SDS-PAGE電泳分析在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，表明融合蛋白成功得到了純化(圖2)。Western Blot驗(yàn)證在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶(圖3)。用SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定融合蛋白濃度為2.395mg/ml。

圖1 鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE電泳圖

M：Protein marker；1：上樣；2：流出；3-5：20mM Imidazole洗脫組分；6-7：50mM Imidazole洗脫組分；8：100mM Imidazole洗脫組分；9-11：500mM Imidazole洗脫組分。

圖2 目的蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

M：Protein marker；1：目的蛋白。

圖3 蛋白Western Blot結(jié)果

M：Protein marker；1：目的蛋白。

2.2 接種VPtdh對大黃魚血清中抗體產(chǎn)生的影響

經(jīng)VPtdh腹腔注射免疫后，大黃魚血清中抗體水平的產(chǎn)生規(guī)律(如圖4)。對照組OD450在0.140~0.173，在28d的實(shí)驗(yàn)期間無顯著差異(P>0.05)。腹腔注射VPtdh后大黃魚血清中抗體水平迅速提高，免疫3d后，實(shí)驗(yàn)組血清中抗體水平高于對照組水平(P<0.05)；在試驗(yàn)的第7d，各實(shí)驗(yàn)組抗體水平顯著高于對照組水平，直到第28d，一直保持高水平值，抗體水平在第21d時達(dá)到最高水平。

圖4 VPtdh對大黃魚血清中抗體產(chǎn)生的影響

2.3 相對免疫保護(hù)率

接種VPtdh 28d后，分別測定大黃魚對副溶血弧菌的相對免疫保護(hù)率(附表)。結(jié)果表明，VPtdh可提高大黃魚抵抗副溶血弧菌的能力。

附表 VPtdh大黃魚對副溶血弧菌的相對免疫保護(hù)率比較（%）

組別攻毒魚尾數(shù)死亡魚尾數(shù)死亡率相對免疫保護(hù)率 123 PPG1032326.770.4 PBS10108990.0/

3 討論

隨著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，高密度集約化的養(yǎng)殖方式致使病害、種質(zhì)、環(huán)境三大問題益嚴(yán)重，成為制約大黃魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。其中病害問題尤為突出，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副溶血弧菌是引起7~9月份引起大黃魚腸炎和皮膚潰爛的主要病原，一直缺少較為有效防控的手段。而當(dāng)前主要通過化學(xué)藥物和抗生素對大黃魚病害進(jìn)行防治，但是抗生素和等化學(xué)藥物的治療對養(yǎng)殖環(huán)境和食品安全造成嚴(yán)重影響，因此，疫苗等免疫制劑作為更安全有效、綠色環(huán)保的藥物，得到養(yǎng)殖從業(yè)者們的青睞。滅活全菌苗作為最常用的疫苗已在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛的應(yīng)用，但存在抗原受損、免疫原性差等缺點(diǎn)。本研究通過基因克隆和原核表達(dá)的方法制備了副溶血弧菌TDH亞單位疫苗，采用注射免疫的方法評價了其免疫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌TDH能顯著提高大黃魚抗體水平和免疫保護(hù)率。可作為一種安全可靠、免疫效果好的藥物用于大黃魚副溶血弧菌的免疫預(yù)防。

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（2018–01–08）

浙江省自然科學(xué)基金（LY 14C190006）浙江省科技計劃項(xiàng)目（2016F10021）

S852.61+3

C

1007-1733(2018)06-0067-03