日照地區(qū)某雞場雞源性大腸桿菌的分離培養(yǎng)及藥敏試驗

薛濤 趙晗 徐國敬 許崇新 王瑞松 （山東省莒縣店子集畜牧獸醫(yī)站 276522）

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日照地區(qū)某雞場雞源性大腸桿菌的分離培養(yǎng)及藥敏試驗

薛濤 趙晗 徐國敬 許崇新 王瑞松 （山東省莒縣店子集畜牧獸醫(yī)站 276522）

本試驗的目的在于研究禽類體內(nèi)的大腸桿菌的分離鑒定并對分離出來的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗來分析耐藥性。本試驗對采集到的某養(yǎng)殖場的20份泄殖腔拭子進(jìn)行分離鑒定，革蘭氏染色，確定了16株大腸桿菌，采用NCCLs推薦的紙片擴散法(Kirby Bauer氏法)對其進(jìn)行了9種藥敏試驗，雞源大腸桿菌對頭孢噻肟、慶大霉素敏感，對氧氟沙星、阿莫西林中度敏感，對多環(huán)丙沙星、恩諾沙星、萘啶酸、四環(huán)素、復(fù)方新諾明已產(chǎn)生了耐藥性。結(jié)果可對禽類大腸桿菌病臨床合理用藥具有指導(dǎo)意義。

雞 大腸桿菌 分離鑒定 藥敏試驗

近幾年，隨著國家經(jīng)濟水平的穩(wěn)步增長，人們消費水平的提高，對于肉蛋奶用量的需求量逐步增加。相對應(yīng)的畜牧行業(yè)的發(fā)展也逐步加快，禽類農(nóng)產(chǎn)品占有一定比例。禽類的腸道內(nèi)含有大腸桿菌，但能夠引起禽類致病的是具有毒力的菌株稱為致病性大腸桿菌。致病性大腸桿菌成為近來危害禽類主要的細(xì)菌性疾病，給禽類生產(chǎn)造成損失[1]。

大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli，又稱大腸埃希氏菌)是由德國Escherich于1885年首次從嬰兒糞便中分離得到的，是人類和動物臨床上重要的致病菌，是近年來食品衛(wèi)生、用水衛(wèi)生及流行病學(xué)領(lǐng)域的研究對象之一[2]。它是革蘭氏陰性菌，單一或成對存在，多為桿狀，無芽孢，兩端鈍圓，多有鞭毛，能運動，有的還含莢膜。大腸桿菌屬于兼性厭氧菌，最適合的生長條件為37℃和pH 7.2~7.4[3]。致病性大腸桿菌根據(jù)不同的生物學(xué)特性可分為5類：腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。該菌對熱的抵抗力較強，55℃加熱60min或60℃加熱15min部分細(xì)菌仍能存活。在自然界的水中可存活較長時間，該菌在溫度較低的糞便中能存活數(shù)月。大腸桿菌能合成維生素B和維生素K，正常棲居條件下不致病；若進(jìn)入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在水和食品中檢出，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)[4]。根據(jù)O、K、H抗原的不同，可將大腸桿菌菌株分為不同的血清型。一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，尤其對嬰兒和幼畜(禽)，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。

大腸桿菌的臨床癥狀不太明顯，由于致病性大腸桿菌類型的不同和雞的生長期、生理機能和免疫狀態(tài)等的差異，發(fā)生的疾病也有所不同。從20世紀(jì)60年代開始就被Gross 、Smith 和 Nakamura等人依次證實[5]，臨床上有以下幾種表現(xiàn)型:急性敗血型、內(nèi)臟型、大腸桿菌性肉芽腫、神經(jīng)型(腦炎型)、關(guān)節(jié)炎或足墊腫型、生殖型(輸卵管炎和卵黃性腹膜炎型)。其中這些表現(xiàn)型中危害最嚴(yán)重的是急性敗血型和生殖型(輸卵管炎和卵黃性腹膜炎)。并且多并發(fā)或繼發(fā)于其它病毒性或細(xì)菌性疾病[6-7]，如繼發(fā)于新城疫或傳染性支氣管炎。

在日照地區(qū)，畜禽的飼養(yǎng)過程中，養(yǎng)殖戶會大量使用抗生素進(jìn)行疾病的治療和增強免疫力，而這個過程往往造成了大腸桿菌在藥物的選擇壓力作用下，產(chǎn)生耐藥性，使疾病更加難以治療。由于雞的大腸桿菌病在臨床上頻發(fā)，其不分日齡，不分季節(jié)的流行特點和病程較長的發(fā)病特點給養(yǎng)殖戶造成了很大困擾，許多人容易病急亂投醫(yī)，可能造成適得其反的效果。這些都表明養(yǎng)殖上需要科學(xué)的理論依據(jù)作指示，本論文對日照地區(qū)某雞場雞源性大腸桿菌進(jìn)行了生化鑒定和藥敏試驗，為了掌握該雞場大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀，旨在為指導(dǎo)該雞場臨床科學(xué)、合理、有效用藥，防治大腸桿菌感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 日照地區(qū)部分規(guī)?；B(yǎng)雞場泄殖腔拭子。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂、LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(Maconkey Agar)為北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；三糖鐵瓊脂為青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨水、葡萄糖磷酸鹽胨水、枸櫞酸鹽均、硫化氫為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片(阿莫西林，四環(huán)素，慶大霉素，頭孢噻肟，氧氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，萘啶酸，復(fù)方新諾明)為杭州天和微生物劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、95%乙醇、30%甘油、草酸銨結(jié)晶紫溶液、革蘭氏碘溶液、石炭酸復(fù)紅、0.9%生理鹽水等試劑。

1.1.3 儀器 光學(xué)顯微鏡、分光光度計(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠)、萬用電爐(龍口市先科儀器公司)、生物潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS-60X75-B上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、電子天平(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠)、ZDX-35BI座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)、DHG—9023A箱電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司)。

1.1.4 培養(yǎng)基的配置 （1）LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：取25.0g溶解于1000ml蒸餾水中，加入20%~30%的甘油，用玻璃棒攪拌加熱至溶解，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。（2）麥康凱瓊脂：取55.0g溶于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，115℃高壓滅菌20min備用。（3）三糖鐵瓊脂(TSI)培養(yǎng)基：將64.5g溶于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，121 ℃高壓滅菌15 min，制成高層斜面?zhèn)溆?。?）營養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar)：取33.0g于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至46℃左右制成平板或者斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 采樣 用滅菌的棉簽緩緩插入雞的泄殖腔內(nèi)，旋轉(zhuǎn)數(shù)下，然后將其放入滅菌的裝有生理鹽水和LB肉湯的10ml離心管內(nèi)，折斷手持部分，做好標(biāo)記，放入冰盒保存。

1.2.2 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈對工作臺進(jìn)行消毒，將裝有棉拭子的離心管放到37℃恒溫箱內(nèi)解凍。在酒精燈火焰附近用接種環(huán)沾取菌液接種到麥康凱培養(yǎng)基內(nèi)，采取三區(qū)劃線法接種細(xì)菌，注意不要劃破瓊脂表面。接種完后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上畫線區(qū)線上生長較好的單菌落，接種到營養(yǎng)瓊脂上。將營養(yǎng)瓊脂放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h。

1.2.3 細(xì)菌的純化與保存 用接種環(huán)從培養(yǎng)基畫線上挑取粉紅色生長較好的單個菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)16~18h。用封口膜封好縫隙，放入冰箱內(nèi)低溫保存，以備后用。在滅菌的離心管內(nèi)加入1000μl的營養(yǎng)肉湯，用滅菌的棉簽涂抹營養(yǎng)瓊脂上的菌落混入肉湯中，用封口膜封口，標(biāo)簽紙寫上編號，放入冰箱內(nèi)低溫保存。

1.2.4 細(xì)菌的革蘭染色及鏡檢 取干凈無油漬的載玻片，通過火焰過火，確保載玻片滅菌干凈。用滅菌接種壞取少量生理鹽水，至于玻片中央，接著用接種環(huán)挑取一個大腸桿菌單菌落于生理鹽水中攪勻，均勻涂成大小合適的薄層。自然晾干并用火焰固定。初染，將草酸銨結(jié)晶紫溶液滴加于干燥、固定好的抹片上，放置1~2min后水洗干凈；媒染，滴上革蘭氏碘溶液，在2~3min后水洗干凈；然后用95%乙醇進(jìn)行脫色，在1min后進(jìn)行水洗；繼續(xù)用石炭酸復(fù)紅進(jìn)行復(fù)染，過3min后用水洗干凈；最后經(jīng)過自然晾干后，再進(jìn)行鏡檢，即可觀察視野中細(xì)菌的形態(tài)。

1.2.5 細(xì)菌的生化鑒定 將所保存的菌放入37℃恒溫箱內(nèi)解凍，用無菌接種環(huán)接菌到生化管內(nèi)和三糖鐵斜面上。三糖鐵瓊脂接種先涂布斜面后穿刺底部，放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h。觀察各生化管顏色變化。當(dāng)生化試管變色后，取出蛋白胨水和葡萄糖磷酸鹽胨水，在蛋白胨水內(nèi)加入先加入乙醚再加入吲哚。葡萄糖磷酸鹽胨水用VP(Voges-Proskauer)法，先加入甲液(6%甲萘酚酒精溶液)再加入乙液(40%氫氧化鉀)。

1.2.6 細(xì)菌的藥敏試驗 在超凈工作臺內(nèi)配得菌液于離心管中。利用紫外分光光度計將菌液濃度調(diào)至108cfu/ml。采用K-B紙片擴散法進(jìn)行藥敏試驗[8]。將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板用記號筆標(biāo)記劃分為四區(qū)。用微量移液器吸取菌液100μl，小心滴于培養(yǎng)基表面中央位置。用無菌涂布棒，將沿一個方向?qū)⒕和坎加谂囵B(yǎng)基平面，改變原來的方向沿垂直方向來回推動涂布，重復(fù)多次使菌液分布均勻。室溫下靜置5~10min，使菌液浸入培養(yǎng)基內(nèi)。用無菌小鑷子分別夾住環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、萘啶酸、頭胞噻肟、四環(huán)素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、阿莫西林藥敏片的邊緣按一定的布局貼在相應(yīng)區(qū)域的中間位置。輕輕按壓使其固定，藥敏紙片一旦接觸平板就不可再移動。作好記錄后置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)18~24h。通過抑菌直徑來評定抑菌效果。直徑越大說明該藥物對菌株的抑菌效果好，菌株對該藥物敏感。測量抑菌圈直徑，取其平均值。不同藥物的判定標(biāo)準(zhǔn)參照臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)[9]，見表1。

表1 各種抗菌藥物紙片含藥量及藥敏試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的生化試驗結(jié)果

大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖均產(chǎn)酸。MR試驗結(jié)果菌株均為陽性，吲哚試驗為陽性，VP試驗結(jié)果為陰性，TSI試驗為陽性，枸櫞酸鹽試驗為陰性，表示不能利用枸櫞酸鹽。TSI試驗陽性，斜面和底層均為黃色，底部有氣泡產(chǎn)生，確定的為4、6、9、10不是大腸桿菌。結(jié)果表2。

表2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

注：“＋”陽性反應(yīng)，“－”陰性反應(yīng)，“⊕”陽性產(chǎn)氣

2.2 細(xì)菌分離率

通過分離培養(yǎng)，20份樣品中分離出16株大腸桿菌，細(xì)菌分離率為80%。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

對20株菌株進(jìn)行藥敏試驗，由表3的數(shù)據(jù)與表1結(jié)合起來得到表4，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)為耐藥率=耐藥菌株數(shù)／測量菌株數(shù)×100%，敏感率=敏感菌株數(shù)／測量菌株數(shù)×100%[9]，由此可知菌株對四環(huán)素(60%)耐藥，大部分對環(huán)丙沙星(50%)、恩諾沙星(50%)、萘啶酸(64.3%)、復(fù)方新諾明(61%)耐藥；對頭孢噻肟(92%)、慶大霉素(81%)高度敏感。

表3 藥敏試驗結(jié)果 (mm)

表4 藥敏試驗結(jié)果分析

3 討論

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定分析

（1）通過細(xì)菌分離培養(yǎng)，雞源大腸桿菌在在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落。對純化后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，染色后為紅色，生物顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)為短小的桿狀，多單個存在，少數(shù)成對出現(xiàn)。通過以上結(jié)果可初步確定所鑒定菌種為革蘭氏陰性桿狀菌。對純化好的細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定試驗。因為不同種類的細(xì)菌對糖的分解利用能力不同，糖發(fā)酵試驗以能否分解某種糖，是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣等現(xiàn)象來鑒別細(xì)菌[10]。大腸桿菌能分解葡萄糖、麥芽糖和乳糖，產(chǎn)酸。本糖發(fā)酵試驗中葡萄糖、麥芽糖均為陽性，乳糖有2株菌株為陰性，其余大多數(shù)為陽性，屬于正常情況，可視其結(jié)果為陽性。大腸桿菌不能利用枸櫞酸鹽，故在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基仍為綠色。本枸櫞酸鹽利用實驗有一株菌株的結(jié)果為陽性，其他均為為陰性，可能是操作過程中污染了雜菌的原因。吲哚Indor試驗、MR試驗結(jié)果過均為陽性，VP試驗結(jié)果均為陰性，TSI試驗有2株為陰性，其他為陽性，視其結(jié)果為陽性。生化鑒定試驗的結(jié)果符合大腸桿菌的生化特性，進(jìn)一步確定所鑒定的樣品為大腸桿菌。（2）在試驗過程中有時會因為操作步驟的不規(guī)范產(chǎn)生一些雜菌，這主要因素有以下幾點：①倒培養(yǎng)基時，錐形瓶的瓶口與培養(yǎng)皿壁有接觸，手碰觸培養(yǎng)皿的邊緣，使雜菌粘到錐形瓶瓶口處，導(dǎo)致錐形瓶內(nèi)的培養(yǎng)基被污染。②在使用生物潔凈工作臺時，沒有先開紫外燈滅菌直接進(jìn)行接菌操作，使空氣中的雜菌落入培養(yǎng)基內(nèi)，影響試驗結(jié)果。③在進(jìn)行保菌處理使用移液器時，移液槍頭碰到已經(jīng)高壓滅菌的離心管的管壁，污染了保存的菌液。在進(jìn)行生化試驗時，加入試劑的時間長短，可以影響生化試驗結(jié)果的顯示。如在做VP試驗時，加入試劑5min內(nèi)生化管上部分會變成黑色，等到15min之后生化管呈現(xiàn)粉紅色，在1h后生化管呈現(xiàn)橘紅色。在不同時間段內(nèi)，生化管的顏色變化就給試驗結(jié)果的判定帶來了影響。根據(jù)試驗結(jié)果來看，分離出的菌株的生化試驗結(jié)果多為陽性，且符合大腸桿菌的生化特性，所以可以判定為分離出的18株菌株為大腸桿菌。

3.2 藥敏試驗?zāi)退幮缘姆治?/h3>

（1）由藥敏試驗結(jié)果表3、表4可知從20株菌株中分離出的16株菌株對環(huán)丙沙星耐藥率50%、中介率14.3%、敏感率35.7%，恩諾沙星耐藥率35.7%、中介率28.6%、敏感率35.7%，氧氟沙星耐藥率14.3%、中介率14.3%、敏感率74.1%，萘啶酸耐藥率64.3%、中介率14.3%、敏感率21.4%，頭孢噻肟耐藥率0%、中介率14.3%、敏感率85.7%，四環(huán)素耐藥率57.1%、中介率為21.4%、敏感率為21.4%，慶大霉素耐藥率7.1%、中介率14.3%、敏感率78.6%，復(fù)方新諾明耐藥率57.1%、中介率28.6%、敏感率14.3%，阿莫西林耐藥率28.6%、中介率7.1%、敏感率64.3%。由此可以看出來14株雞源大腸桿菌菌株全部對頭孢噻肟慶大霉素高度敏感，對其他藥物都有一定的耐藥性，其中對氧氟沙星、復(fù)方新諾明、阿莫西林較敏感。從表3還可以知道，大多數(shù)菌株對所有藥物都有一定的耐藥性，即表現(xiàn)為不同的多重耐藥現(xiàn)象，還有交叉耐藥現(xiàn)象。（2）從結(jié)果可以看出來，雞源大腸桿菌對臨床上較少使用的藥物較敏感，較多使用的藥物有耐藥性，而且對廣譜抗菌藥的耐藥性也在增加。這說明大腸桿菌對藥物的適應(yīng)能力越來越強，產(chǎn)生耐藥性的速度也越來越快。所以臨床使用藥物時不能為了提高抗生素的治療效果就頻繁的換藥，另外從交叉耐藥上這一點來看不能隨便將幾種藥物混合使用。正是因為在實際藥物應(yīng)用的時候沒有按照藥物規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)使用，才使得應(yīng)用時藥物劑量不足，或者為了防止某些禽類疾病隨便往禽類適量里添加抗菌藥物，從而導(dǎo)致禽類體內(nèi)的大腸桿菌對某些藥物出現(xiàn)耐藥性。（3）隨著我國養(yǎng)禽業(yè)現(xiàn)代化、集約化的發(fā)展，大量的抗菌藥物被投用于作為細(xì)菌感染的首選藥物，抗菌藥物的不合理使用和濫用的情況嚴(yán)重，導(dǎo)致家禽體內(nèi)和飼養(yǎng)環(huán)境中的大腸桿菌的耐藥性逐漸升高，藥物的作用能力逐漸降低，養(yǎng)殖場只能延長藥物使用的時間、加大投放藥物的劑量和選擇更新的藥物(頭孢類)解決藥力降低的問題，導(dǎo)致大腸桿菌在大強度的抗菌藥物壓力作用下，產(chǎn)生更高的耐藥性，甚至出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象。當(dāng)前部分養(yǎng)殖場，為了節(jié)約飼養(yǎng)成本，多數(shù)在飼料和飲用水中加入抗生素來預(yù)防疾病的發(fā)生，但這種盲目的防治措施恰恰增大了細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的可能。目前研究最多的是食源性家畜和家禽，從食源性動物中分離的大腸桿菌可能是耐藥因子在人體和環(huán)境互相轉(zhuǎn)移的重要媒介，當(dāng)食源性的耐藥菌轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，會對人的健康造成威脅。

本試驗結(jié)果和研究資料表明，大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象已經(jīng)非常普遍，應(yīng)當(dāng)加強這方面措施控制耐藥性升高的趨勢。首先在對禽類進(jìn)行藥物使用之前，應(yīng)該進(jìn)行藥物的敏感性分析，禁止濫用藥物。依據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇使用相應(yīng)的抗菌類藥物，并且要嚴(yán)格按照說明來決定使用劑量的多少，從而降低雞源大腸桿菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的幾率。另外，臨床用藥時也可與其他藥物配伍使用，多采用聯(lián)合用藥、交叉用藥等方式，從而來提高抗生素的治療效果。同時也可以用中藥來進(jìn)行輔助，中藥具有毒副作用小，無耐藥性產(chǎn)生等優(yōu)點。

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（2018–6–20）

S852.61+2

A

1007-1733(2018)06-0008-04

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