基于新型小鵝瘟病毒VP3基因間接ELISA快速檢測方法的建立

曲藝 刁非非 王斌 趙曉燕 熊華萱 陶濤 陸冠亞 王水明* （南京出入境檢驗檢疫局 江蘇 南京 210000 東營市正邦養(yǎng)殖有限公司 山東 東營）

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基于新型小鵝瘟病毒VP3基因間接ELISA快速檢測方法的建立

曲藝①刁非非②王斌①趙曉燕①熊華萱①陶濤①陸冠亞①王水明①*（①南京出入境檢驗檢疫局 江蘇 南京 210000 ②東營市正邦養(yǎng)殖有限公司 山東 東營）

應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增了新型鵝細(xì)小病毒(NGPV)的VP3基因，然后將其克隆到原核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒pGEX-VP3。將pGEX-VP3轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)后分別用SDS-PAGE和Western-blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定。然后以表達(dá)的VP3蛋白作為抗原，包被ELISA板。分別對包被抗原的濃度、抗原封閉條件、血清的孵育條件、酶標(biāo)二抗的孵育條件等進(jìn)行優(yōu)化，最終成功建立間接ELISA。VP3蛋白的包被稀釋度為1:800，4℃包被過夜，5%脫脂乳4℃封閉過夜，血清稀釋度為1:120，酶標(biāo)二抗稀釋度為1:1000，孵育時間為30min。此方法有良好的重復(fù)性及特異性，為臨床檢測新型細(xì)小病毒感染以及疫苗評價提供了參考方法。

新型小鵝瘟病毒 VP3蛋白 ELSIA 快速檢測

2014年下半年來，在我國華東地區(qū)發(fā)生了一種以雛鴨發(fā)育遲緩，上下喙萎縮，舌頭外伸、腫脹、下垂為特征的疾病，該疾病被命名為鴨短喙-侏儒綜合征。該病的發(fā)病率為10%~20%，嚴(yán)重時可達(dá)50%，患鴨生長發(fā)育受阻，短喙舌頭外伸導(dǎo)致飲水、采食困難，出欄體重明顯低于健康鴨只，嚴(yán)重者僅為正常體重的50%[1]。部分患鴨還出現(xiàn)單側(cè)行走困難、癱瘓等癥狀，并且發(fā)病鴨群日齡越小，大群的發(fā)病率越高，這給養(yǎng)鴨業(yè)造成了較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。刁有祥、陳少鶯等人認(rèn)為該病病原為一種新型小鵝瘟病毒(NGPV)或GPV變異株[2-4]。因該病為近年新發(fā)疾病，對該種病毒的生物學(xué)特性研究尚未清晰，對于該病的診斷防治也缺乏更進(jìn)一步的研究。本研究利用純化的新型小鵝瘟病毒VP3蛋白作為包被抗原，建立與病毒中和抗體相關(guān)的間接ELISA檢測方法。本研究旨在提升我國動物疫病檢測水平，為國家新型動物疫病診斷防控、保障畜牧業(yè)健康發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料方法

1.1 引物的設(shè)計[5]

參照NGPV株的全基因組序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計特異性引物以擴(kuò)增VP3基因片段，上下游引物分別引入酶切位點(Hind III和Xho I)。引物序列如表1。

表1 NGPV VP3基因上、下游引物序列

1.2 重組VP3蛋白的原核表達(dá)

1.2.1 NGPV毒株的核酸提取及PCR擴(kuò)增[6] 提取NGPV毒株的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物切膠回收。

1.2.2 重組VP3表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[7]將純化的PCR產(chǎn)物與原核表達(dá)質(zhì)粒載體pGEX-4T-1，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序正確的質(zhì)粒被命名為pGEX-VP3。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)分析及純化[8]將VP3重組表達(dá)菌及空載體質(zhì)粒菌液轉(zhuǎn)接到含Amp的LB 液體培養(yǎng)基中。加入IPTG誘導(dǎo)后，取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的菌液離心，棄上清。菌體中加入PBS，凍融2次后，冰上放置超聲波破碎至菌液變的通透清亮，將超聲后的液體離心，分別收集上清及沉淀，沉淀用尿素溶解。取上清和溶解后的沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳后觀察蛋白表達(dá)情況及可溶性。若目的條帶出現(xiàn)在上清，則為可溶性蛋白，若在沉淀中出現(xiàn)，則蛋白以包涵體形式存在。

1.2.4 重組蛋白的Western blot鑒定 Western blot方法鑒定重組蛋白，一抗為實驗室制備的抗新型鵝細(xì)小病毒多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗鴨IgG，純化后的VP3蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將目的條帶剪下，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗和二抗后用化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.3 基于VP3蛋白的間接ELISA方法的建立[9]

1.3.1 抗原蛋白包被濃度及血清稀釋度的確定 經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化后的重組VP3蛋白濃度5.7mg/ml。每個抗原稀釋度設(shè)置三個重復(fù)，方陣滴定法確定抗原包被濃度及血清稀釋度，選擇OD值接近1的包被條件。

1.3.2 封閉條件的選擇 對所選的3種封閉液分別做3次重復(fù)，取平均值，選擇OD值接近1的封閉條件。

1.3.3 酶標(biāo)二抗稀釋度的優(yōu)化 不同濃度的酶標(biāo)二抗做三個重復(fù)對照，取平均值，選擇OD值接近1的工作濃度。

1.3.4 血清孵育時間及酶標(biāo)二抗孵育時間優(yōu)化 血清孵育時間設(shè)3組平行對照，取平均值，選擇接近1的OD值以確定血清孵育時間，以同樣的方法確定的酶標(biāo)二抗孵育時間。

1.4 對ELISA方法的驗證

1.4.1 重復(fù)性和敏感性驗證 運(yùn)用建立的間接ELISA方法對10份已知NGPV陰陽性血清進(jìn)行重復(fù)性檢測。取6份陽性血清，從1:200開始進(jìn)行倍比稀釋，分別檢測不同稀釋度，以檢出陽性最大的稀釋度作為其敏感度。

1.4.2 特異性試驗 每組設(shè)置3個平行對照，取8種特異性陽性血清用建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組VP3蛋白的原核表達(dá)

（1）VP3基因的PCR結(jié)果(附圖A)，在約1600bp可見明顯的PCR條帶，與目的條帶的1630bp吻合。將純化的改PCR產(chǎn)物與載體接連后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，在5kb和1.6kb出有明顯的PCR條帶證明VP3基因正確連接到載體中(附圖B)。（2）重組VP3蛋白的表達(dá)分析及純化結(jié)果顯示，誘導(dǎo)pGEX-VP3重組菌獲得大小約84kDa的蛋白，與預(yù)測的蛋白大小一致?？扇苄苑治鲲@示，重組VP3蛋白以包涵體形式存在(附圖Ci)。用包涵體粗純化方法對重組 VP3蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS- PAGE檢測純化后蛋白(附圖Cii)。純化蛋白經(jīng)透析復(fù)性，用BCA 蛋白測定試劑盒測定復(fù)性蛋白的濃度為5.7mg/ml。（3）重組VP3蛋白的 Western blot鑒定結(jié)果顯示，純化的VP3蛋白在蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量約84k Da處出現(xiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期的蛋白大小84k Da相符(附圖D)，表明制備的NGPV的VP3蛋白可與本實驗室制備的多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，具有很好的抗原性。

附圖 重組VP3蛋白原核表達(dá)結(jié)果

A: NGPV毒株VP3 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果。B:重組質(zhì)粒pGEX-VP3的雙酶切鑒定結(jié)果。C(i-ii)：重組蛋白的SDS-PAGE 分析結(jié)果。D：重組蛋白的Western-blot鑒定。Lane1:pGEX-VP3菌液，Lane2：pGEX-4T-1菌液，Lane3：超聲波上清，Lane4：超聲波沉淀，Lane5：未純化的重組VP3蛋白，Lane6：純化的重組VP3蛋白。

2.2 基于VP3蛋白的間接ELISA方法的建立

2.2.1 抗原蛋白包被濃度及血清稀釋度 結(jié)果如表2，選擇OD值接近1，因此確定VP3蛋白的包被稀釋度為1:800，蛋白濃度7.1μg/ml，血清稀釋度為1:120。

表2 VP3蛋白抗原包被濃度和血清稀釋度的選擇

2.2.2 封閉條件 結(jié)果如表3，選擇5%脫脂奶粉作為封閉液，并對封閉時間優(yōu)化，最終確定封閉條件為5%脫脂乳4℃過夜(表4)。

表3 封閉液的選擇

表4 封閉時間的選擇

2.2.3 酶標(biāo)二抗稀釋度的優(yōu)化 結(jié)果如表5，二抗稀釋度確定為1:1000。

表5 酶標(biāo)二抗稀釋度選擇

2.2.4 血清孵育時間及酶標(biāo)二抗孵育時間優(yōu)化 選擇接近1的OD值以確定血清孵育時間，確定其血清孵育時間為30min(表6)，以同樣的方法確定酶標(biāo)二抗孵育時間為30min(表7)。

表6 血清孵育時間優(yōu)化

表7 二抗孵育時間優(yōu)化

2.3 對ELISA方法的驗證

2.3.1 重復(fù)性和敏感性驗證 結(jié)果顯示批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于9%。如下表8，說明所建立的的間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性。且如表9可以確定建立的間接ELISA方法靈敏度為1:800。

表8 間接ELISA的重復(fù)性驗證

表9 VP3蛋白ELISA方法敏感度檢測

2.3.2 特異性試驗 結(jié)果顯示鵝細(xì)小病毒及番鴨細(xì)小病毒檢測結(jié)果均接近1，表明建立的ELISE方法對其他水禽細(xì)小病毒屬成員也有檢測作用，這也在臨床檢測上證明了新型鵝細(xì)小病毒是由鵝細(xì)小病毒變異而來的推測。而其他病原陽性血清檢測值小于0.3，表明此方法對非細(xì)小病毒的檢測特異性良好。

表10 特異性檢測結(jié)果

3 討論

（1）原核表達(dá)的方法簡單，成本低廉且表達(dá)量高，表達(dá)的蛋白經(jīng)復(fù)性后可直接作為抗原在實驗中運(yùn)用，是病毒蛋白研究中最常用的方法。VP3蛋白是NGPV的核衣殼蛋白，是主要的抗原成分，因此VP3蛋白是理想的包被抗原，相比于全病毒包被抗原其不具有生物安全威脅。本研究中原核表達(dá)的NGPV VP3蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)后以包涵體形式存在，且蛋白表達(dá)量高，經(jīng)包涵體純化后復(fù)性得到的純化重組蛋白VP3經(jīng)Western-blot檢測具有很好的抗原性。（2）本研究以原核表達(dá)的重組VP3蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，建立了基于NGPV VP3蛋白的鴨血清抗體檢測的間接ELISA方法。通過對各個條件優(yōu)化后，獲得了標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：重組VP3蛋白1:800稀釋(4度包被過夜)，5%脫脂奶4度封閉過夜，血清1:120稀釋后作用30min，酶標(biāo)二抗1:1000稀釋后作用30min，顯色15min即可。對該ELISA方法進(jìn)行特異性交叉反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其對番鴨細(xì)小病毒及鵝細(xì)小病毒呈現(xiàn)非特異性，對其他水禽病原的檢測都具有特異性。且所建立的間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性，為臨床水禽細(xì)小病毒感染檢測以及NGPV滅活疫苗評價提供了參考方法。（3）本研究所建立的間接ELISA方法檢測鴨血清NGPV抗體仍存在一定的不足，此方法無法區(qū)分臨床上細(xì)小病毒感染的種類也不能判斷血清中抗體的產(chǎn)生是病毒感染還是疫苗免疫引起的，會繼續(xù)對該方法進(jìn)行改進(jìn)以解決本方法的不足。

[1] Chen, H., Y. Dou, Y. Tang, Z. Zhang, X. Zheng, X. Niu, J. Yang, X. Yu and Y. Diao. Isolation and Genomic Characterization of a Duck-Origin GPV-Related Parvovirus from Cherry Valley Ducklings in China. Plos One, 2015, 10(10): e0140284.

[2] 李傳峰, 李琦, 陳宗艷, 劉光清等. 鴨短喙-侏儒綜合征病原的初步鑒定[J]. 中國動物傳染病學(xué)報, 2015, 23(6): 1-6.

[3] Chen, H., Y. Dou, Y. Tang, X. Zheng, X. Niu, J. Yang, X. Yu and Y. Diao. Experimental reproduction of beak atrophy and dwarfism syndrome by infection in cherry valley ducklings with a novel goose parvovirus-related parvovirus. Veterinary Microbiology, 2016, 183: 16.

[4] Chen, S., S. Wang, X. Cheng, S. Xiao, X. Zhu, F. Lin, N. Wu, J. Wang, M. Huang and M. Zheng. Isolation and characterization of a distinct duck-origin goose parvovirus causing an outbreak of duckling short beak and dwarfism syndrome in China. Archives of Virology, 2016, 161(9): 1-10.

[5] 宮曉華. 新型鴨細(xì)小病毒DS-15株生物學(xué)特性研究及間接ELISA方法的建立[D]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué): 合肥. 2017.

[6] 李琦, 李傳峰, 唐井玉等. 新型鴨細(xì)小病毒VP3基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2016 (6): 717-722.

[7] Zhang, Y., Y. Li, M. Liu, D. Zhang, D. Guo, C. Liu, H. Zhi, X. Wang, G. Li and N. Li. Development and evaluation of a VP3-ELISA for the detection of goose and Muscovy duck parvovirus antibodies. Journal of Virological Methods, 2010, 163(2): 405-409.

[8] Wang, Q., H. Ju, Y. Li, Z. Jing, L. Guo, Y. Zhao, B. Ma, M. Gao, W. Zhang and J. Wang. Development and evaluation of a competitive ELISA using a monoclonal antibody for antibody detection after goose parvovirus virus-like particles(VLPs)and vaccine immunization in goose sera. Journal of Virological Methods, 2014, 209(2): 69.

[9] Guo, L., Z. Q. Jing, L. Li, H. Y. Ju, B. Ma and J. W. Wang. Preparation and identification of monoclonal antibodies against VP3 protein of goose parvovirus. Chinese Veterinary Science, 2010, 40(2): 169-173.

（2018–06–21）

江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃項目計劃，編號：2017KJ39

S852.65+9

A

1007-1733(2018)06-0004-03