國槐花活性多糖抗氧化和免疫增強(qiáng)作用的研究

李卓悅 馮玉祥 張洪影 于忠芳 李可 閆振貴 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 泰安 271018）

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國槐花活性多糖抗氧化和免疫增強(qiáng)作用的研究

李卓悅?馮玉祥?張洪影 于忠芳 李可 閆振貴*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 泰安 271018）

本研究旨在探討國槐花多糖的體外抗氧化活性和免疫增強(qiáng)作用，為國槐花藥品和功能食品的開發(fā)提供參考依據(jù)。采用水提醇沉法從國槐花干粉中提取粗多糖，并經(jīng)除蛋白、脫色素等處理獲得精制國槐花多糖，其總糖含量為56.75%，蛋白含量為1.57%；選取小鼠為動物模型，研究國槐花多糖對正常小鼠免疫機(jī)能的影響，結(jié)果表明，與正常對照組小鼠相比，國槐花多糖能提高小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞的增殖能力和血清抗體效價，其中高劑量組均達(dá)到顯著水平；體外抗氧化試驗表明，國槐花粗多糖對DPPH?和H2O2具有較強(qiáng)的清除能力，且其清除率具有劑量依賴性；因此，國槐花多糖具有較好的抗氧化性和免疫增強(qiáng)活性。

國槐花 多糖 免疫增強(qiáng) 抗氧化

槐花又名槐蕊，是豆科植物槐的干燥花蕾或花朵，味苦、性微寒,歸肝、大腸經(jīng)?；被ê卸喾N生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分，是具有顯著臨床療效的天然藥物，具有清熱瀉火等作用，其水煎劑及提取物還有抗菌、抗炎、抗病毒、凝血、止血、影響心血管系統(tǒng)等作用。

上世紀(jì)初，國內(nèi)外研究確定槐花中含有多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、植物甾類、鞣質(zhì)及微量元素等多種化學(xué)成分。曹小燕等[9]以秦巴山區(qū)野生槐花為試驗材料，采用單因素試驗結(jié)合正交實驗方法建立了纖維素酶－超聲輔助提取槐花多糖的工藝條件。王麗華等[4]采用四因素三水平正交試驗設(shè)計, 獲得了槐花水溶性多糖提取的最佳工藝條件。趙慶友等[5]研究表明，不同劑量槐花多糖均能提高雛雞的免疫器官指數(shù)，并且提高雛雞免疫新城疫疫苗后的抗體水平和外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。然而，有關(guān)國槐花多糖的提取純化及抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的研究鮮有報道。因此，本研究擬從國槐花干粉中提取國槐花多糖，研究國槐花多糖的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性，為國槐花干粉的應(yīng)用、天然安全食品抗氧化劑、免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 雞新城疫病毒(ND)

1.1.2 試驗動物及生物制劑 5周齡健康雄性潔凈級小鼠，購自泰安泰邦生物公司；國槐花瓣，收集自泰山周邊新鮮的國槐花瓣；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液，購自天津灝洋生物有限公司；紅細(xì)胞裂解液，購自康為世紀(jì)有限公司。

1.1.3 主要化學(xué)試劑 無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、MTT試劑等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 高速冷凍離心機(jī)，型號CR21GII(日本日立公司)；JA1203A電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(山東濰坊醫(yī)療器械廠)；電熱恒溫水槽，型號DK-8D(上海精宏實驗設(shè)備有限公司；太倉精宏儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品)；QL-901漩渦震蕩儀(澳門市其林貝爾儀器制造有限公司)；WD-9406B水平搖床(沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 國槐花多糖的提取和純化 采用水提醇沉法提取國槐花多糖，稱取200g干燥至恒重的國槐花干粉，置索氏提取器中，加入石油醚，水浴回流脫去脂肪；將除脂的國槐花粉末與去離子水按1:15(W：V)的比例混合，在85℃條件下用蒸餾水反復(fù)浸提3次，合并濾液，離心，去除沉渣，取上清液，然后濃縮至原體積的1/4；待濃縮液冷卻后，緩慢加入3倍體積的無水乙醇并攪拌混勻，4℃靜置過夜；次日，經(jīng)低溫離心，得到醇沉后的絮狀沉淀，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌兩次，最后用少量去離子水將多糖沉淀溶解，凍干，即得國槐花粗多糖。稱取適量國槐花粗多糖，經(jīng)Sevage法除蛋白、雙氧水法除色素，并進(jìn)行透析、洗滌等處理后，獲得精制國槐花多糖[1]。

1.2.2 國槐花多糖總糖和蛋白含量的測定 （1）總糖的測定：采用苯酚硫酸法[2]測定國槐花多糖的的含量。配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，準(zhǔn)確稱取20mg葡萄糖，用純水定容至100 mL。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行稀釋，得到濃度梯度為 30、50、100、150、200μg/ml的系列溶液。準(zhǔn)確吸取1.0ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次置于5支具塞試管內(nèi)，然后分別加入0.5ml 5%的苯酚溶液和2.5ml濃硫酸，輕搖混勻，25℃放置20min后，用分光光度計于490nm處測定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。國槐花多糖中糖含量的測定方法與標(biāo)準(zhǔn)品相同，將干燥恒重后的多糖配制成溶液，按照以上方法操作，于490nm處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。（2）蛋白含量的測定：采用Bradford 法[3]測定國槐花多糖中蛋白含量。用1.0mg/ml濃度的牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)液。分別取2ml，加入3ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，2min后，在595nm下測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。配置0.5mg/ml的多糖樣品溶液，依據(jù)上述方法測定吸光度后，代入方程計算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 動物實驗設(shè)計 5周齡雄性昆明小鼠64只，隨機(jī)分成4組，每組2籠，每籠8只。分組及各組劑量如下：第I組為高劑量組，每只小鼠按400mg?kg-1的劑量皮下注射國槐花多糖；第II組為中劑量組，每只小鼠按200mg?kg-1的劑量皮下注射國槐花多糖；第III組為低劑量組，每只小鼠按100mg·kg-1皮下注射國槐花多糖，第IV組為空白對照組，皮下注射生理鹽水；連續(xù)注射7d。在第8d，所有小鼠皮下注射免疫1羽份的ND疫苗。分別在免疫后7、14、21d采集樣品，采樣前12h內(nèi)，小鼠禁食不禁水。

1.2.4 國槐花多糖對小鼠免疫機(jī)能的影響 （1）免疫器官指數(shù)：免疫后7、14、21d，各組隨機(jī)取5只小鼠，稱重及采血后剖殺。分別摘取胸腺、脾臟并稱重，計算免疫器官指數(shù)(g/kg) =免疫器官重量/活體重。（2）血清抗體效價的檢測：免疫后7、14、21d，采集各組小鼠的血液，分離血清，采用β半微量血凝抑制(HI)法測定血清抗NDV抗體效價，HI抗體效價以Log2X表示[6]。

1.2.5 國槐花多糖對小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響 采用倍比稀釋的方法用RPMI1640培養(yǎng)液將國槐花多糖溶液(1mg/ml)依次稀釋至0.977μg/ml，總共8個濃度梯度。每個時期對小鼠眼球采血2ml，肝素抗凝。將血樣1倍稀釋并混勻，緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液上層，離心。小心吸取中間云霧狀淋巴細(xì)胞層并用Hank's液洗滌兩次，離心，再使用紅細(xì)胞裂解液除去淋巴細(xì)胞團(tuán)中的紅細(xì)胞雜質(zhì)，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)大于90%后，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至每毫升1.5×106個，每孔加多糖100μl，各濃度3孔，另設(shè)細(xì)胞對照孔。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，各孔加MTT試劑30μl，用酶聯(lián)免疫儀檢測570nm處的吸光度值。若多糖組的吸光度值顯著大于對照組，則表明多糖能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖[7]。

1.2.6 國槐花多糖的抗氧化作用的研究 （1）國槐花多糖對DPPH的清除能力的測定 參照已有方法并略作修改，配置濃度為0.1mmol/L的DPPH?乙醇溶液。分別取 0.5ml不同濃度的國槐花多糖溶液樣品，加入2.0ml DPPH?乙醇溶液，然后加入1.5ml去離子水充分混勻，快速振蕩，在室溫下避光放置30min后，采用分光光度計于517nm處測定吸光度，以抗壞血酸(Vc)作為陽性對照，每個樣本重復(fù)三次，取平均值[8]。（2）國槐花多糖對H2O2清除能力的測定：參考現(xiàn)有方法并略作修改，將國槐花多糖配置成不同的濃度梯度。取15ml的玻璃試管，分別加入2.4ml 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH7.4)和0.6ml 40mM的H2O2溶液，然后分別加入1ml的國槐花多糖溶液，混勻，劇烈震蕩，對照不添加國槐花多糖溶液，于室溫下放置10min，在230nm下測定吸光度值，每個樣本重復(fù)3次。以水替代國槐花多糖溶液，作為對照實驗。抗壞血酸(Vc)用作陽性對照。每個樣本重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 國槐多糖的提取及測定結(jié)果

用水提醇沉的方法，國槐花粗多糖的得率為12.13% (w/w)。純化的國槐花多糖經(jīng)苯酚硫酸法測定的總糖含量約為56.75%，Bradford法測定的蛋白含量為1.57%, 表明國槐多糖可能是一種蛋白結(jié)合型多糖。

2.2 國槐多糖對小鼠體重的影響

由表1可見，在免疫后的第7d，3個多糖組(I、II、III)的小鼠體重均高于對照組(IV)，其中，第I組(高劑量組)的小鼠體重顯著高于對照組(IV)；而在免疫后的第14和21d，第I、II、III組的小鼠體重與對照組(IV)差異不顯著(P>0.05)。

表1 國槐花多糖對小鼠體重的影響 （g）

注：同列數(shù)值后標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下表類同。

2.3 國槐花多糖對小鼠免疫機(jī)能的影響

2.3.1 免疫器官指數(shù) 由表2可見，在免疫后的第7、14和21d，第I、II、III組的胸腺指數(shù)均高于第IV組，其中第I組(高劑量組)的胸腺指數(shù)顯著高于對照組(IV)；另外，脾臟指數(shù)的變化規(guī)律與胸腺指數(shù)類似。

表2 國槐花多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

2.3.2血清抗體效價 由表3可見，在免疫后7、14和21 d，第I、II和III組的效價均高于第IV組，其中，第I組顯著高于第IV組(P<0.05)；另外，第I組的效價均高于第II和III組，但差異不顯著(P>0.05)第IV組，結(jié)果表明，國槐花多糖能顯著小鼠免疫NDV后的血清抗體效價。

表3 國槐花多糖對免疫NDV小鼠血清抗體效價的影響 (Log2)

2.4 國槐花多糖對小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表4可見，在免疫后7、14和21 d，與第IV組(空白對照)相比，第I、II和III組均顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.05)，其中，第I組的增殖效果顯著高于第II和III組，(P<0.05)。

表4 國槐花多糖對小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.5 國槐花多糖體外抗氧化效果

2.5.1 國槐花多糖對DPPH?的清除能力 由圖1可見，在一定濃度范圍內(nèi)，國槐花粗多糖對DPPH? 自由基有一定的清除能力，其清除DPPH? 自由基能力隨著國槐花粗多糖濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，但是其清除率遠(yuǎn)低于作為陽性對照的Vc。

圖1 國槐花多糖對DPPH的清除能力

2.5.2 國槐花多糖對H2O2的清除能力 由圖2可見，在一定范圍內(nèi)，國槐花粗多糖對H2O2具有較強(qiáng)的清除能力，且其清除率隨著國槐花粗多糖濃度增加而逐漸增強(qiáng)。作為陽性對照的Vc對H2O2具有很強(qiáng)的清除能力，濃度為1mg/mL時，其清除率就已在90%以上。

圖2 國槐花多糖對H2O2 的清除能力

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，國槐花多糖能促進(jìn)小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育，提高其生長性能，其中高劑量組的效果最顯著；對小鼠的外周血淋巴細(xì)胞具有增殖作用，其中高劑量組效果最好；不同濃度的國槐花多糖均能提高小鼠的抗體水平，其中高劑量組最顯著；國槐花多糖具有較好的體外抗氧化能力，在一定范圍內(nèi)隨濃度增加而增強(qiáng)。

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（2018–09–19）

山東省2016年度自然科學(xué)基金面上項目(ZR2016CM26)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201710434201)；動科院“雙一流”學(xué)科經(jīng)費(fèi)

S816.7

A

1007-1733(2018)06-0001-03

?共同第一作者；