NF-κB和IκB-a蛋白表達(dá)水平變化與老年癡呆發(fā)病相關(guān)性分析及作用機(jī)制分析

朱登玲，姜阿利，王慧峰，劉潘，徐鳳琴，王霞

(開封美寶空分醫(yī)院內(nèi)科，河南 開封 475002)

老年癡呆病的最主要形式為阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease，AD），約占所有老年癡呆病患者比例的60%左右，此外本病具有不可逆性和隱匿性，對(duì)患者的正常生活和家庭均帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]。AD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，通過AD發(fā)病機(jī)制以尋找治療和預(yù)防AD的新藥已成為現(xiàn)階段AD研究的重要方向。

核因子－κB （nuclear factor－kappa B，NF－κB）是具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄功能的核蛋白因子，其激活和表達(dá)的上調(diào)可反映炎癥反應(yīng)、血管損傷和細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度。NF－κB在多類神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中均存在分布，可作為信使傳遞突觸信號(hào)至核內(nèi)而發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)癡呆大鼠海馬 NF－κB和抑制和轉(zhuǎn)錄因子－κB （inhibitor nu鄄clear factor－kappa B，IκB）關(guān)系密切。 故此，本研究深入探討了NF－κB和IκB－a蛋白表達(dá)水平變化與老年癡呆發(fā)病的相關(guān)性并討論其在臨床上應(yīng)用的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取我院確診的老年癡呆患者120例（AD組）、體檢正常的健康對(duì)象50例（對(duì)照組），收集時(shí)間2013年4月－2017年3月，臨床資料通過回顧患者的病歷記錄和病例報(bào)告獲得。

AD組，男性63例、女性57例，年齡48～85歲，平均年齡 67．2±13．1 歲；惡化程度：第一階段 37例，第二階段49例，第三階段34例。對(duì)照組，男性24例，女26例，年齡45～77歲，平均年齡63．1±12．2歲。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

1．2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1．2．1 納入標(biāo)準(zhǔn)[4]⑴各項(xiàng)檢測均確診為老年癡呆患者；⑵有完整規(guī)范的術(shù)后病理報(bào)告及隨訪資料；⑶無高血壓、糖尿病、腎炎等疾病。

1．2．2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。⑵未能完成隨訪者。⑶貧血及凝血功能障礙；⑷風(fēng)濕及免疫系統(tǒng)疾?。虎蓢?yán)重的肝腎功能疾病。

1．3 免疫組化及蛋白質(zhì)免疫印跡方法 免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法檢測兩組對(duì)象腦脊液中的NF－κB和 IκB－a蛋白表達(dá)情況。

免疫組化法：活檢患者大腦病變組織，繼續(xù)固定24h，常規(guī)石蠟切片，片厚5μm；選擇特異性抗體，通過免疫組織化學(xué)SP法定性分析NF－κB和IκB－a 蛋白表達(dá)情況；

蛋白印跡法：提取蛋白后BCA法檢測相關(guān)濃度，10ug單孔上樣進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶90min，25℃封閉；3%脫脂牛奶混勻一抗；4℃孵育過夜；一抗孵育后清洗3次，3%脫脂牛奶混勻二抗，IgG 濃度為 1：800；90min 28℃孵育后清洗 3次，顯影[5]。

1．4 免疫組化及蛋白質(zhì)印跡判定標(biāo)準(zhǔn)[6]免疫組化結(jié)果判定：陰性對(duì)照用PBS代替一抗進(jìn)行染色，結(jié)果做為陰性；以在呈現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒為陽性，按陽性細(xì)胞所占比例數(shù)分為：染色強(qiáng)度分為－(陰性)、+(弱)、++(中度)、+++(強(qiáng))； 染色范圍為－(0%～5%)、+(6%～25%)，++(26%～50%)、+++(＞50%)。兩種蛋白陽性表達(dá)結(jié)果中，(－)歸為陰性表達(dá)組，(+)、(++)、(+++)歸為陽性表達(dá)組。采用免疫印跡（Western blot）法測定各組織中 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表達(dá)水平（灰度值＞15．0 為陽性）。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 16．0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析法；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；圖像分析系統(tǒng)(Image－pro Plus 6．0)計(jì)算 NF－κB 和 IκB－a 的積分光密度(Integral opticaldensity，IOD)。 P 值＜0．05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組組織標(biāo)本中的 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表達(dá)情況比較 AD組、對(duì)照組的NF－κB蛋白表達(dá)陽性率分別為 68．33%、18．00%（P＜0．001），見表 1。 IκB－a 蛋白陽性率分別為 20．00%、72．00%（P＜0．01），見表2。

表1 組織標(biāo)本中的NF-κB蛋白表達(dá)情況比較

表2 組織標(biāo)本中的IκB-a蛋白表達(dá)情況比較

2．2 NF－κB 和 IκB－a 蛋白印跡檢測結(jié)果 NF－κB在 AD 組的表達(dá)水平為 32．33±0．7， 明顯高于對(duì)照組的表達(dá)水平 （P＜0．05）；IκB－a 在 AD 組的表達(dá)水平為 15．22±0．3， 明顯低于對(duì)照組的表達(dá)水平 （P＜0．05）。 見表 3。

表3 Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平比較

2．2 老年癡呆患者 NF－κB 和 IκB－a 蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 NF－κB和IκB－a蛋白表達(dá)率和相對(duì)含量在不同的年齡、性別、惡化程度中，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表 4。

3 討論

目前，我國的老齡化趨勢日益嚴(yán)重，老年癡呆的發(fā)病率亦上升明顯，本病是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，病因迄今未明。老年癡呆是多種疾病因素相互作用而誘發(fā)，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，免疫假說、氧化應(yīng)激假說、基因突變假說及膽堿功能低下假說均為當(dāng)下較為流行的老年癡呆發(fā)病機(jī)制假說[7]。

表4 老年癡呆患者NF-κB和IκB-a蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

研究[8]認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致老年癡呆患者認(rèn)知功能障礙的最關(guān)鍵的因素之一，老年癡呆可誘發(fā)腦內(nèi)出現(xiàn)一系列炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而損傷神經(jīng)元。NF－κB由氧化還原因子－1進(jìn)行氧化還原調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，可結(jié)合抑制蛋白I－κB家族而形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞漿中[9]。經(jīng)活化作用后I－κB與NF－κB出現(xiàn)解離而進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。資料[10]亦顯示I－κB和NF－κB與細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，是一類重要的調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路。本研究中老年癡呆患者腦脊液中NF－κB和IκB－a蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。 上述結(jié)果說明老年癡呆患者存在炎癥反應(yīng)并提示NF－κB和IκB－a蛋白具有老年癡呆早期診斷的重要疾病指標(biāo)的潛力。

研究[11]發(fā)現(xiàn)NF－κB普遍存在于真核細(xì)胞中，是一種具有序列特異性的二聚體結(jié)構(gòu)，可通過胞漿將信息傳至細(xì)胞核而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。安靜狀態(tài)下，異源或同源二聚體NF－κB結(jié)合IκB－a蛋白而形成三聚體而以無活性狀態(tài)存在細(xì)胞質(zhì)中。外界因素刺激細(xì)胞后可激活蛋白激酶IκK并在其作用磷酸化IκB，經(jīng)過泛素－蛋白激酶降解后分離NF－κB，激活NF－κB并將其移位至細(xì)胞核內(nèi)，與DNA接觸并形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抑制或啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的作用進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[12]。

老年癡呆患者NF－κB和IκB－a蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系結(jié)果顯示NF－κB和IκB－a蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、和病情惡化階段有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。 上述結(jié)果說明者NF－κB和IκB－a蛋白表達(dá)與老年癡呆患者的病情發(fā)展關(guān)系密切。NF－κB具有神經(jīng)損傷和保護(hù)的雙重作用，其中損傷作用主要取決于NF－κB產(chǎn)生的具體位置、產(chǎn)生量、活化信號(hào)（刺激物）、神經(jīng)元所處位置和持續(xù)時(shí)間等多種因素。先前的研究[13]證實(shí)神經(jīng)元突觸、突觸后及胞體致密層具有活性的NF－κB具有將突觸信息傳送至細(xì)胞核中的信使功能，認(rèn)為NF－κB活化是導(dǎo)致神經(jīng)元等許多類型細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一。最新的研究[14，15]顯示NF－κB發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可分為以下幾點(diǎn)：⑴誘導(dǎo)錳過氧化物歧化酶的轉(zhuǎn)錄；⑵促進(jìn)神經(jīng)元凋亡抑制蛋白MAP的表達(dá)；⑶抑制谷氨酸受體亞單位的表達(dá)；⑷穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣和增加鈣結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄； ⑸誘導(dǎo)凋亡抑制因子 Bcl－2、Bcl－xl的表達(dá)。經(jīng)過研究我們認(rèn)為對(duì)老年癡呆的治療可通過調(diào)節(jié) Ref－1－NF－κB－IκB 氧化還原通路為研究點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)保護(hù)作用，提高老年癡呆患者的記憶能力，但具體結(jié)果還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，NF－κB 和 IκB－a 蛋白表達(dá)與老年癡呆發(fā)病具有密切的聯(lián)系，有望成為檢測老年癡呆的指標(biāo)。