揚(yáng)州市乙型肝炎病毒B基因型前S基因特征分析

肖越勝 ，張軍 ，唐陽(yáng) ，楊立坤 ，張晉

(1、揚(yáng)州市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，江蘇 揚(yáng)州 225001；2、揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 揚(yáng)州 225001)

人乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）屬嗜肝DNA病毒科，基因組是不完全閉合環(huán)狀雙鏈DNA，長(zhǎng)度約3．2kb，有四個(gè)部分重疊的開(kāi)放式閱讀框（ORF），前 S/S 區(qū)（PreS/S）、PreC/C、Pol、X。 其中PreS/S區(qū)編碼大、中、小3種包膜蛋白。HBV序列異質(zhì)性是一個(gè)特征，源于其較高的病毒復(fù)制產(chǎn)量及突變率，該突變是由于在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中缺乏校對(duì)的酶而造成的。長(zhǎng)期的自發(fā)性突變使基因序列產(chǎn)生差異，依據(jù)HBV DNA全序列的核苷酸差異，共分 A－I九個(gè)基因型[1，2]。HBV 基因型中存在混合感染的現(xiàn)象和明顯的地域分布，我國(guó)HBV感染以 B和 C型為主，占 90%以上[3，4]，南方以 B和 C型為主，A型和D型在我國(guó)東部地區(qū)有少量存在。HBV在復(fù)制過(guò)程中催化逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的酶缺乏3’－5’核酸外切酶活性，從而缺乏校正功能，不能修正在外界選擇壓力改變下C、S區(qū)等產(chǎn)生的變異，使其抗原性減弱，產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象。目前有關(guān)HBV S區(qū)基因變異與乙肝疫苗免疫失敗、肝移植乙肝免疫球蛋白逃逸、隱匿性HBV感染等方面的研究較多[5，6]。揚(yáng)州市HBV感染以基因B、C型為主[7]，但在感染過(guò)程中病毒的前S基因變異和特征目前未有報(bào)道。

1 材料與方法

1．1 樣本來(lái)源 樣本采自本中心門(mén)診，靜脈采血，3000rpm離心，取血清進(jìn)行乙型肝炎病毒核酸(HBV－DNA)熒光PCR檢測(cè)，留取核酸陽(yáng)性樣本－70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 試劑和儀器 HBV DNA熒光定量PCR，艾肯生物技術(shù)有限公司（杭州）；Viral Nucleic Acid Iso鄄lation Kit，江蘇碩世生物科技有限公司；PreS引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR試劑，寶生物工程（大連）有限公司；普通PCR儀和電泳儀，美國(guó)BIO－RAD公司。

1．3 研究方法

1．3．1 血清熒光PCR檢測(cè)，取具有典型熒光擴(kuò)增曲線的標(biāo)本，按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行基因分型，取基因B型病毒 7株 YZ01－YZ07，其中 YZ01－YZ04病毒載量大 于 105copies/ml，YZ05－YZ07 病 毒 載 量 小 于105copies/ml。

1．3．2 PreS PCR 引物， 采用 DNAStar PrimerSelect設(shè)計(jì)HBV PreS基因區(qū)間通用引物，上游引物YZS－A：5′－cgaaaaggcatggggacaaatc(nt2872－2983)；下游引物 YZS－B：5′－ggagccaccagcaggaaagta(nt49－70)， 產(chǎn)物 414bp。 擴(kuò)增條件：94℃ 1min；98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 30s，35 個(gè)循環(huán)。

1．3．3 PreS 基因擴(kuò)增片段，1．5%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序。

1．3．4 基因分析 參考序列為從GenBank下載的HBV A－H基因型的序列，分別為A基因型：X51970；B 型 ：033554，AB073858，AF121244，AF100309，D00329；C 型 ：AB014381，AB033556，AF068756，X04615；D 型 ：M32138，X65259；E 型 ：AB032431，X75657；F 型 ：AB036910，X69798；G型 ：AB064310，AF160501；H 型 ：AY090454，AY090457。20條參考序列與研究樣本序列用BioEdit軟件對(duì)齊，DNAStar MegAlign軟件Clustal W比對(duì)構(gòu)建距離矩陣，采用neighbor－joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

1．3．5 將研究樣本序列和基因 B型參考序列(nt2926－70)用EditSeq翻譯成氨基酸序列后，輸入MegAlign比對(duì)。翻譯的氨基酸序列共120AA，對(duì)應(yīng)表位是 PreS：AA27－146。

2 結(jié)果

2．1 PreS片段PCR結(jié)果 將已分型的7株病毒核酸進(jìn)行PreS基因片段擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示擴(kuò)增結(jié)果與設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段大小相符，證明PCR擴(kuò)增模板為HBV DNA（見(jiàn)圖1）

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2．2 同源性分析 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序成功6條。將所測(cè)PreS基因片段序列和20條參考序列經(jīng)軟件比對(duì)，得出基因比對(duì)矩陣。揚(yáng)州市6例樣本間同源性分別為 97．2%～98．6%，其中 YZ07 與 YZ02、03 同源最高為 98．6%，與 YZ06 最低為 97．2%，與同基因型參考株的同源性為：92．8%～100%。參考序列033554與研究樣本間同源性為：92．8%～94．8%，與 YZ06 的同源性最低為92．8%，低于其他基因B型參考序列。參考序列AF121244與研究樣本間同源性高于其他基因B參考序列，與YZ03的同源性最高為100%，。研究樣本與其他基因型參考株間的同源性為：78．1%～86．2%，與基因 H 型的同源性最低。

2．3 遺傳進(jìn)化分析 將測(cè)序結(jié)果和參考序列共26條序列對(duì)齊后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果顯示26條序列分成8個(gè)分支，分別對(duì)應(yīng)A～H 8個(gè)基因型 （圖2）。揚(yáng)州6株序列與B型參考序列在一個(gè)大分支上，證明所選樣本均為HBV基因B型。其中YZ01、02、06、07 與 AF121244、AF100309 在同一小分支上，遺傳距離較近，YZ03、04各在單一的小分支上，與其他序列無(wú)共用分支。另3株B型參考株在其他分支上，與研究樣本的遺傳距離較遠(yuǎn)。

2．4 PreS基因突變位點(diǎn) 揚(yáng)州6株序列和在同一小分支上同源性最高的基因B型參考序列AF121244按1．3．5方法比對(duì)后發(fā)現(xiàn)存在缺失和突變現(xiàn)象。YZ07發(fā)現(xiàn)有4個(gè)突變位點(diǎn)，YZ06有3個(gè)突變位點(diǎn)，YZ01有1個(gè)突變位點(diǎn)，6例研究樣本中3例發(fā)生突變，分別為PreS：AA39．YZ06缺失谷氨酸，AA44．YZ07天冬氨酸由天冬酰胺替代(D→N突變)，AA45．YZ07亮氨酸由苯丙氨酸替代 （L→F突變），AA78．YZ07絲氨酸由天冬酰胺替代 （S→N突變），AA108.YZ07亮氨酸由苯丙氨酸替代（L→F突變），AA109.YZ01和YZ06絲氨酸由蘇氨酸替代（S→T突變），AA114.YZ06天冬氨酸由纈氨酸替代（D→V 突變）。 YZ02、03、04與參考序列比對(duì)未發(fā)現(xiàn)突變。

圖2 揚(yáng)州市6株病毒與20條參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

3 討論

人乙型肝炎病毒的流行在揚(yáng)州以基因B和C型為主，本研究發(fā)現(xiàn)，揚(yáng)州市HBV B基因型間同源性高，所研究樣本之間的同源性高于與參考株間的同源性，且在遺傳進(jìn)化樹(shù)中，與AF121244和AF100309的在同一小分支上，表現(xiàn)為較強(qiáng)的親緣關(guān)系，說(shuō)明揚(yáng)州HBV間遺傳距離近，流行地域特征明顯。

S 區(qū)分為 PreS（preS1、preS2)和 S 基因，分別編碼表面蛋白的大蛋白、中蛋白和主蛋白，其中大蛋白對(duì)HBV的感染吸附起關(guān)鍵作用。PreS基因包含許多B或T細(xì)胞表位并發(fā)揮多種功能[8]。因此PreS基因的突變會(huì)引起病毒外殼蛋白組成的改變，影響到B或T細(xì)胞的識(shí)別，影響到免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的識(shí)別，是傳統(tǒng)疫苗產(chǎn)生免疫失敗主要原因[9]。人類(lèi)白細(xì)胞抗原 (HLA)-I類(lèi)分子結(jié)合來(lái)自胞內(nèi)加工的肽段，因此這些分子提供消除胞內(nèi)病毒并在胞內(nèi)浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞[10]。到目前為止人們已在8種HBV基因型中發(fā)現(xiàn)60種HBV特異性的HLAI限制性表位和32種HBV特異性的HLA-Ⅱ限制性表位[11]。許智慧[12]發(fā)現(xiàn)乙肝患者HBV PreS/S的表位變異降低了病毒對(duì)CTL(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)結(jié)合的親和力，S區(qū)中S基因?yàn)楸Ｊ貐^(qū)域，其變異率較低，而PreS1基因的變異率高于S基因。本研究的6株樣本發(fā)現(xiàn)PreS基因有7個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，存在較高的突變率。PreS基因突變率隨著肝病的進(jìn)程呈現(xiàn)明顯遞增的趨勢(shì)，基因突變促進(jìn)了肝病的進(jìn)展[13]。因HBV不同位點(diǎn)的缺失和突變的意義不同，對(duì)肝病的進(jìn)程和病毒免疫都有重要影響，研究不同位點(diǎn)的突變對(duì)臨床和被動(dòng)免疫有重要作用。揚(yáng)州6株P(guān)reS區(qū)氨基酸的突變?yōu)辄c(diǎn)突變，且氨基酸替代未改變極性，所以蛋白質(zhì)抗原性未發(fā)生改變。低病毒載量YZ06、YZ07發(fā)現(xiàn)7個(gè)突變點(diǎn)，而高病毒載量病毒株僅YZ01存在1個(gè)，低于王社梁等[14，15]的研究，這或許與肝炎病毒是否處于活動(dòng)期、病情所處階段以及是否長(zhǎng)期服藥等有一定的關(guān)系。突變積累以及氨基酸替換的點(diǎn)位是否會(huì)影響本地的被動(dòng)免疫，有待進(jìn)一步觀察。由于本次研究樣本數(shù)較少，影響突變位點(diǎn)和氨基酸替換率統(tǒng)計(jì)，未發(fā)現(xiàn)突變優(yōu)勢(shì)株，不能明確基因型與臨床表型之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)的突變是否對(duì)臨床有意義，有待以后研究。