低分子量肝素對大鼠SAP胰腺和肺組織形態(tài)學(xué)的影響

劉斌焰 ,邢雁霞 ,趙一錦 ,李 祥 ,李 婷 ,王 佳 ,劉斌鈺 ?

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所,山西大同037009）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是臨床常見的急腹癥，大約25%可轉(zhuǎn)化為重癥急性胰腺炎(Se?vere Acute Pancreatitis，SAP)[1]。SAP病變兇險(xiǎn)、常伴有全身的多器官并發(fā)癥[2-3]，因此死亡率較高。SAP是多病因疾病，與胰酶過度自身消化、胰腺微循環(huán)障礙、炎癥細(xì)胞過度激活及腸道細(xì)菌易位等有關(guān)。低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWP）具有抗凝、抗炎、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。課題組前期研究顯示LMWP對大鼠SAP的肝和腎組織損傷具有保護(hù)作用[5-6]，本實(shí)驗(yàn)探討LMWP對大鼠SAP胰腺和肺組織形態(tài)學(xué)的影響作用。

1 材料和方法

1.1 藥品與動(dòng)物

低分子量肝素為北京永康藥業(yè)產(chǎn)品（15100501）；雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量400±25 g，購于北京維通利華公司。

1.2 試劑

?；悄懰徕c為美國Sigma公司產(chǎn)品,血清TNF-a和IL-6試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品,蘇木精和伊紅為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

冰凍切片機(jī)(Leica，CM1950)，臺式冷凍離心機(jī)(D78532型)德國Hettich公司；酶標(biāo)儀(ELX800型)美國BIO-TEK儀器公司。

1.4 方法

取雄性Wistar大鼠36只，采用?；悄懰徕c制備SAP模型，造模方法參見文獻(xiàn)[7]；造模后隨機(jī)分為2組，模型組和低分子量肝素組（簡稱肝素組），模型組立即給予等劑量溶劑，肝素組給予低分子量肝素100 iu/kg，每日2次腹腔注射，0.1 mL/100 g每次；每組又分為術(shù)后6、12和24 h 3個(gè)亞組，6只/組。

1.5 組織標(biāo)本制備

各組于術(shù)后6、12和24 h取胰腺和肺組織，置10%中性緩沖甲醛液中固定24 h，常規(guī)制成石蠟塊切片，蘇木精—伊紅（HE）染色，供病理檢測。光鏡下采集術(shù)后6、12和24 h大鼠胰腺和肺組織圖像，拍照并統(tǒng)計(jì)每個(gè)完整切面的炎細(xì)胞數(shù)；隨機(jī)采集5個(gè)/張切片不重疊視野圖像，借助Image-ProPlus6.0計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)完成。

1.6 生化指標(biāo)檢測

在術(shù)后6、12和24 h取血分離血清，用雙抗體夾心法(ELISA)法測定血清TNF-α和IL-6含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低分子量肝素對SAP大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響

2.1.1 胰腺肉眼觀察結(jié)果

大鼠ST造模后，在6、12和24 h時(shí)間點(diǎn)，模型組大鼠胰腺出現(xiàn)不同程度的出血或壞死樣改變，胰腺及胰周組織出現(xiàn)皂化斑，伴血性腹水；肝素組大鼠胰腺出血或壞死程度、胰腺和胰周皂化斑及血性腹水均較模型組有不同程度的減輕。

2.1.2 胰腺組織病理學(xué)檢查HE

染色結(jié)果顯示，SAP模型組6 h胰腺小葉間隙增寬，排列不整齊，伴炎細(xì)胞浸潤和出血；12 h胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，組織大片壞死，壞死區(qū)域腺泡結(jié)構(gòu)消失；24 h胰周脂肪片狀壞死，細(xì)胞玻璃樣變、核溶解消失，壞死區(qū)有不同程度炎細(xì)胞浸潤（圖1A）。各時(shí)間點(diǎn)肝素組的胰腺腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞、腺泡腫脹、腺泡細(xì)胞變性和胰小葉壞死程度較模型組明顯減輕，可見胰島結(jié)構(gòu)，病變區(qū)域炎細(xì)胞浸潤減少，隨低分子量肝素治療時(shí)間的延長，病變逐漸減輕（圖1B）。

圖1 大鼠SAP胰腺形態(tài)學(xué)變化（HE×400）

2.1.3 胰腺組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

胰腺病理評分參考Kusske[8]標(biāo)準(zhǔn)，觀察胰腺水腫、出血、壞死、炎細(xì)胞浸潤情況并以此行病理學(xué)評分，見表1。

表1 胰腺組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

2.1.4 胰腺組織病理學(xué)評分

得分=水腫+壞死+炎細(xì)胞浸潤+出血。大鼠模型組與肝素組胰腺組織病理學(xué)評分，6、12和24 h不同時(shí)間t值分別為7.36、9.08、7.32，P＜0.001,見圖2。

圖2 大鼠SAP胰腺組織病理評分

2.2 低分子量肝素對SAP大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響

2.2.1 肺組織肉眼觀察的結(jié)果

模型組大鼠胸腔內(nèi)可見多量的淡黃色或血性胸水，肺組織有不同程度出血水腫，并隨時(shí)間延長逐漸加重；肝素組大鼠胸腔內(nèi)見少量胸水，肺組織有輕度出血水腫，并隨低分子量肝素的作用時(shí)間延長而減輕。

2.2.2 肺組織病理學(xué)檢查

HE染色結(jié)果顯示，SAP模型組6 h肺組織炎細(xì)胞浸潤明顯，肺間質(zhì)有充血水腫及出血現(xiàn)象，12 h可見肺泡腔內(nèi)出血明顯，炎細(xì)胞浸潤，鄰近肺泡隔斷裂形成肺大泡，24 h可見肺泡間隔增寬、肺泡萎陷和肺泡融合形成肺大泡（圖3A）；肝素組的肺組織炎細(xì)胞浸潤、出血等病理形態(tài)改變較模型組輕（圖3B）。

圖3 大鼠SAP肺形態(tài)學(xué)變化（HE×400）

2.2.3 肺組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

肺組織病理評分參照Hofbauer等[9]標(biāo)準(zhǔn)對大鼠肺組織病理變化進(jìn)行評分，以水腫、炎細(xì)胞浸潤和出血程度、肺實(shí)質(zhì)組織和空肺泡所占面積的百分比來判斷肺損傷的程度。評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 肺組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.4 肺組織病理學(xué)評分

得分=水腫+炎細(xì)胞浸潤+出血+肺實(shí)質(zhì)面積+肺空泡面積。大鼠模型組與肝素組6、12和24 h肺組織病理學(xué)評分t值分別為5.76、5.34、9.02，P＜ 0.001,見圖4。

圖4 大鼠SAP肺組織病理評分

2.3 低分子量肝素對SAP大鼠血清

血清TNF-α和IL-6的檢測，采用ELISA相應(yīng)TNF-α和IL-6試劑盒進(jìn)行。結(jié)果見圖5～6。

圖5 大鼠SAP血清TNF-a比較

結(jié)果顯示，術(shù)后6、12、24 h血清TNF-α水平肝素組與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01）；術(shù)后不同時(shí)間血清IL-6的水平肝素組與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01）。

圖6 大鼠SAP血清IL-6比較

3 討論

低分子量肝素分子量低，平均為4 000～6 000，李介秋和范欽橋等[10-11]學(xué)者研究顯示，LMWP抑制胰微血管內(nèi)微血栓形成,同時(shí)還能使形成的微血栓溶解，從而達(dá)到改善胰腺微循環(huán),減輕缺血-再灌注損傷和胰腺壞死。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：胰腺水腫、炎細(xì)胞浸潤、出血和壞死以12～24 h最重，肝素組胰腺損傷程度比模型組明顯減輕胰腺病理；肺組織病理結(jié)果顯示肝素組肺損傷程度比模型組明顯減輕。本結(jié)果提示低分子量肝素早期干預(yù)可減輕SAP胰腺和肺組織病理改變。程潔等[1]Meta分析結(jié)果顯示，LMWP通過減少炎性介質(zhì)釋放，改善微循環(huán)，減少急性胰腺炎發(fā)展為SAP，減少并發(fā)癥，降低死亡率。

TNF-a和IL-6均參與SAP炎癥瀑布式級聯(lián)反應(yīng)，參與胰腺及肺等胰外器官損傷并起著重要作用[12]。本實(shí)驗(yàn)觀察到TNF-a和IL-6水平從術(shù)后6 h開始升高，12 h繼續(xù)上升，24 h出現(xiàn)不同程度的降低；在相同時(shí)間點(diǎn)肝素組與模型組比較，TNF-a和IL-6水平均下降（P＜0.001），提示低分子量肝素通過抑制血清TNF-a和IL-6的水平，可以減輕SAP胰腺和肺損傷。

4 小結(jié)

低分子量肝素降低血清TNF-a和IL-6水平，抑制炎細(xì)胞聚集，減輕全身和胰腺組織炎癥反應(yīng)，緩解胰腺和肺組織病變。