鵝FAR1基因克隆與表達(dá)分析

安 晨 ，杜 壘 ,2，顧天天 ，羅 璇 ，路 璐 ，徐 琪 *，陳國宏

（1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州市邗江區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，江蘇揚(yáng)州 225009）

我國養(yǎng)鵝歷史悠久，品種資源豐富。鵝與其他家禽一樣，有著較強(qiáng)的就巢習(xí)性，浙東白鵝作為我國一個優(yōu)良的地方品種，也具有極強(qiáng)的就巢性。鵝的就巢性與卵泡發(fā)育密切相關(guān)，家禽的卵泡發(fā)育和等級的建立是由多因素共同調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程[1]。

脂肪?；o酶A還原酶1（Fatty Acyl-CoA Reductase 1 ，F(xiàn)AR1）為FAR1蛋白參與脂肪酸向脂肪醇的轉(zhuǎn)化所必需，同時也是合成單酯和醚脂所必需的。Cheng等[2]研究顯示，F(xiàn)AR1和FAR2cDNA編碼可將脂肪酸還原為脂肪醇的同工酶。Honsho 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AR1作為一種縮醛磷脂合成的限速酶，其在中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)了縮醛磷脂合成。研究證明，在長鏈脂肪酸的重要生物代謝合成過程中，F(xiàn)AR起正向調(diào)控作用[4]。以上研究表明，F(xiàn)AR1參與調(diào)控脂類合成。

一般認(rèn)為，禽類卵巢沒有合成脂質(zhì)的能力，卵泡脂質(zhì)幾乎全部源于肝臟。但最近有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞能大量合成脂質(zhì)[5]；楊星[6]也發(fā)現(xiàn)，在小鼠圍排卵期，卵子及顆粒細(xì)胞中存在著細(xì)胞內(nèi)脂滴儲備。本課題組前期通過高通量測序發(fā)現(xiàn)FAR1參與FSH介導(dǎo)的鵝顆粒細(xì)胞增殖[7]，但FAR1在鵝的不同生理時期表達(dá)規(guī)律尚不清楚。本研究克隆了鵝的FAR1基因，并利用 RT-qPCR 檢測浙東白鵝不同等級卵泡和不同就巢時期間 mRNA 表達(dá)變化，以期探明FAR1在鵝生殖調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及來源 選取產(chǎn)蛋時期和3個不同就巢時期（前期：剛剛就巢時，母鵝神情安靜專注，雙翅半張，把蛋置于腹下和翅下，并經(jīng)常用腳和喙翻蛋；中期：就巢前期持續(xù)5～7 d后，每天蹲伏時間大于前期，飲食飲水次數(shù)較前期大大減少；后期：就巢鵝每天臥息時間逐漸減少，開始出巢走動，變得活潑）的浙東白鵝母鵝各3只，安樂死后立即取其卵巢和卵泡。刺破卵泡，將卵泡與卵巢用PBS緩沖液清洗3～4次，去除卵黃物質(zhì)。所有實驗?zāi)根Z均來自于江蘇省泰州市國家級水禽基因庫。

1.2 實驗器材及試劑

1.2.1 實驗器材 實驗所需使用的所有剪刀、鑷子、無酶槍頭、離心管、PCR 管等耗材均經(jīng)高壓滅菌后60烘干備用。

超低溫冰箱、電子天平、超凈工作臺、漩渦混合器、高速冷凍離心機(jī)、瓊脂糖水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電熱恒溫水浴鍋、PCR儀等。

1.2.2 實驗試劑 Trizol Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒、DNA Marker DL2 000來自于天根生化科技有限公司；pMD19-T載體、LA Taq、E.coli DH5αCompetent Cells、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0來自于TaKaRa生物公司；SYBR?Green Master Mix來自于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 總RNA提取與cDNA合成 采用 Trizol Reagent分別提取鵝卵巢、卵泡組織的總RNA。取2 μg卵巢總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明以 Oligo dT 為引物合成cDNA 第一鏈，放入-80 環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4FAR1基因cDNA克隆與測序 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，RT-PCR 擴(kuò)增鵝FAR1基因。反應(yīng)總體系為 20 μL：cDNA 模板 1 μL（100 ng/μL），LA Taq 10 μL，上、下游引物各 1 μL（10 pmol/μL），補(bǔ)充ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 預(yù)變性5 min；95 變性30 s、61 退火30 s、72 延伸2 min，35個循環(huán)；72 終止反應(yīng)10 min；4 保存；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

經(jīng)MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 試劑盒純化后，連接到 pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)大腸桿菌，菌落PCR鑒定為陽性克隆，使用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，之后送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.5FAR1基因生物信息學(xué)分析 利用 DNAMAN 軟件進(jìn)行同源性比對，用 MEGA 6.0 軟件計算奈氏遺傳距離矩陣，并以距離矩陣鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6FAR1基因表達(dá)分析 使用實時熒光定量 PCR 對FAR1進(jìn)行檢測（引物見表1）。反應(yīng)總體系為20 μL：AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL， 上、 下 游 引 物 各 0.4 μL（10 pmol/μL），cDNA 2 μL（100 ng/μL），RNase-free dH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序：①預(yù)變性：95 5 min ；②循環(huán)反應(yīng)：95 10 s ，60 30 s ，循環(huán)40次；③熔解曲線：95 15 s，60 60 s，95 15 s。

1.7 統(tǒng)計分析 對鵝組織樣品內(nèi)標(biāo)基因GAPDH和目標(biāo)基因FAR1進(jìn)行實時熒光 PCR檢測，采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1FAR1基因克隆 以鵝卵巢組織cDNA為模板，DL2000為Maker，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到5'端第1次擴(kuò)增 44 bp，第2次擴(kuò)增190 bp，2次共計擴(kuò)增213 bp；3'端第1次擴(kuò)增85 bp，第2次擴(kuò)增269 bp，2次共計擴(kuò)增354 bp。鵝FAR1mRNA序列長為1 869 bp，其中包括83 bp的5'UTR和229 bp的 3'UTR和1 557 bp的開放閱讀框，共編碼518個氨基酸（圖1、2）。

2.2 鵝FAR1基因及其編碼的蛋白質(zhì)分析 為了分析FAR1的進(jìn)化關(guān)系，利用 MEGA 6.0 軟件構(gòu)建了10個物種的分子進(jìn)化樹，通過自引導(dǎo)檢驗獲得的系統(tǒng)分支置信度（重復(fù)1 000次），分為哺乳動物、禽類、植物和菌四大類。由圖3可知，在鵝與野鴨之間自展值較高為97，可信度高，說明鵝與鴨的親源性最高。采用DNAMAN分析各物種間同源性，結(jié)果顯示鵝與鴨直接同源性最高為85.52%，符合進(jìn)化樹結(jié)果。

表1 PCR 引物信息

圖 1 FAR1基因PCR產(chǎn)物片段

圖 2 FAR1 5'RACE（A）和3'RACE(B)擴(kuò)增

圖 3 不同物種推導(dǎo) FAR1 氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

2.3 等級前卵泡與等級卵泡中FAR1的表達(dá)變化 如圖4所示，卵巢FAR1mRNA 的表達(dá)量顯著高于等級前卵泡和F5、F4等級卵泡（P＜0.05）；且等級卵泡表達(dá)量高于等級前卵泡（P＜0.05）；但FAR1mRNA 的表達(dá)量在等級前卵泡和等級卵泡中無顯著差異(P＞0.05)。

2.4 不同就巢時期FAR1的表達(dá)變化 如圖5所示，F(xiàn)AR1mRNA的表達(dá)在產(chǎn)蛋期與就巢期有顯著差異（P＜0.05），且在就巢后期顯著高于就巢前期和中期（P＜0.05）。

圖 4 不同等級卵泡中FAR1 mRNA 相對表達(dá)量

圖 5 不同就巢時期FAR1 mRNA 相對表達(dá)量

3 討 論

目前，在家禽中關(guān)于FAR1的研究尚無相關(guān)報道，因此，本實驗在鵝卵巢和不同就巢時期卵泡中研究了FAR1基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，浙東白鵝、綠頭鴨、原雞三者聚為一類，說明浙東白鵝FAR1基因與鳥類遺傳進(jìn)化距離最近。

Lehtinen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，可以通過FAR1的過表達(dá)提高脂肪醛和蠟酯的生產(chǎn)。Round等[9]在紅球藻的研究中發(fā)現(xiàn)FAR1促進(jìn)紅球藻蠟積累。Jian-Kai等[10]研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母中FAR1異源表達(dá)可以產(chǎn)生脂肪醇。Sturmey等[11]研究表明，內(nèi)源性脂質(zhì)可作為卵母細(xì)胞和早期胚胎的能量底物。禽類卵黃脂質(zhì)沉積量會伴隨卵泡的發(fā)育不斷增多，且等級卵泡比等級前卵泡發(fā)育速度快，卵母細(xì)胞在最后階段會從血液中快速地攝取營養(yǎng)物質(zhì)，沉積卵黃[12]。禽類最大卵泡（F1）或蛋黃中脂肪含量豐富，雞為30%～33%[13]，鴨高達(dá)36.8%[14]。

目前，普遍認(rèn)為禽類卵巢脂肪合成能力很低，卵泡中幾乎所有脂肪皆源于肝臟[15]。卵泡發(fā)育早期脂肪含量少后期多，這與本研究中FAR1表達(dá)相似，在等級前卵泡中FAR1表達(dá)顯著低于等級卵泡。Rizzo等[16]研究發(fā)現(xiàn)，正常脂肪醛和醇代謝是表皮分化和功能的關(guān)鍵。因此推測隨著卵泡發(fā)育，卵泡膜的層數(shù)及面積不斷擴(kuò)增，脂肪醛和醇代謝不斷增加，F(xiàn)AR1的表達(dá)隨之增強(qiáng)。

FAR1的穩(wěn)定性取決于一種細(xì)胞中磷脂水平調(diào)節(jié)的機(jī)制[3]。在鵝就巢時期，鵝的采食量下降，卵巢嚴(yán)重皺縮，卵泡停止發(fā)育。這一現(xiàn)象使得鵝從體外攝取的脂肪減少，相應(yīng)的膜類結(jié)構(gòu)減少，推測構(gòu)成膜類主要成分的磷脂減少又促使FAR1的表達(dá)降低，最后在鵝就巢時期FAR1的表達(dá)明顯低于產(chǎn)蛋期。隨著就巢的進(jìn)行，在就巢后期卵巢皺縮逐漸恢復(fù)，相應(yīng)的磷脂需求增加，F(xiàn)AR1的表達(dá)又相應(yīng)增加。

4 結(jié) 論

本研究首次克隆出鵝FAR1cDNA序列，并通過RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得了FAR1mRNA全長序列，這對更深入地研究FAR1基因的功能提供了參考。此外，本研究還通過對不同等級卵泡和不同就巢時期卵泡FAR1mRNA的表達(dá)進(jìn)行測定，初步確定FAR1在卵巢和卵泡發(fā)育中參與其脂類代謝。