攜IR780碘化物液態(tài)氟碳納米粒造影劑的制備及體外雙模態(tài)成像

劉明珠，張 萍，2*，王志剛，2，曹 陽，郭 丹，譚米肖，汪星月

(1.重慶市超聲影像學(xué)研究所 超聲分子影像學(xué)重慶市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010)

單一模式成像已不能滿足現(xiàn)代日益增長的多樣化臨床醫(yī)學(xué)需求，多種影像學(xué)技術(shù)相結(jié)合已成為近年來的研究熱點(diǎn)[1]。作為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域無創(chuàng)成像的新型技術(shù)，光聲成像是光學(xué)成像和聲學(xué)成像的結(jié)合，前者利用不同生物介質(zhì)之間獨(dú)特的光譜特性顯示生物組織的分布，后者利用聲波良好的穿透性、指向性、折射及反射等物理特性對病變組織進(jìn)行顯像[2-4]?？捎糜诠饴暢上窈蛡鹘y(tǒng)超聲成像的雙模態(tài)造影劑既可結(jié)合傳統(tǒng)超聲成像的高空間分辨力，又可增強(qiáng)組織之間的對比度，具有廣闊應(yīng)用前景。支持進(jìn)行光聲成像的材料種類多樣，且敏感性高、特異性強(qiáng)，已得到廣泛應(yīng)用，特別是在近紅外光區(qū)域(700～1 000 nm)有強(qiáng)烈吸收峰的材料，具有良好的光穩(wěn)定性[5-7]。IR780碘化物是一種七甲川花菁染料，在近紅外區(qū)有很強(qiáng)的吸光度值，不溶于水，穩(wěn)定性好，毒性低，體內(nèi)循環(huán)時間長[8]。支持通過液氣相變進(jìn)行超聲成像的液態(tài)氟碳種類較多，其中沸點(diǎn)相對較低(29℃)的全氟戊烷(perfluoropentane， PFP)更易發(fā)生相變，超聲成像效果好[9]。本研究將IR780碘化物聯(lián)合PFP包裹于生物相容性的高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid)， PLGA]內(nèi)，構(gòu)建一種能進(jìn)行超聲/光聲雙模態(tài)成像的納米粒造影劑PLGA-IR780-PFP(IFNPs)，并評估其體外超聲/光聲雙模態(tài)成像的效果。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑 Olympus IX71光學(xué)顯微鏡，Nikon AIR激光共聚焦顯微鏡，Zeta SIZER 3000HS馬爾文粒徑分析儀，Hitachi H-7600透射電子顯微鏡，JEOL JEM-7800F掃描電子顯微鏡，SHIMADZU UV-2550紫外分光光度計，Sonics & Materials聲振儀，Mid-River FC-808-2W-MM 808 nm激光儀，Mylab 90超聲診斷儀(LA523線陣探頭，頻率4～10 MHz)，Vevo LAZR光聲成像儀。羥基端乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，分子量12 000，聚合比 50∶50)，PFP(Strem Chemicals公司)，IR780碘化物(Sigma公司)，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol， PVA；Sigma公司)；二氯甲烷(成都市科隆化學(xué)品有限公司)，異丙醇(重慶川東化工有限公司)。

1.2IFNPs的制備 采用雙乳化法，將50 mg PLGA-COOH和2 mg IR780碘化物加入4 ml二氯甲烷(分散相)中，于常溫下震蕩，并置于超聲波清洗儀內(nèi)充分混勻。在冰浴條件下加入200 μl PFP，聲振3 min(100 W，聲振5 s、停止5 s)，再加入10 ml 4% PVA溶液(連續(xù)相)，聲振2 min(60 W，聲振5 s、停止5 s)。將上述溶液加入到10 ml的2%異丙醇溶液內(nèi)混勻，再轉(zhuǎn)移至50 ml的燒杯，加磁珠置于磁力攪拌器上攪拌3 h使二氯甲烷充分揮發(fā)，經(jīng)去離子水離心、洗滌3次(8 000 rot/min，8 min)，獲得IFNPs。制備過程全程避光。

1.3IFNPs一般性質(zhì)檢測 以光學(xué)顯微鏡觀察IFNPs大小及分散性；第一次聲振前向混合物中加入少量DiI染液，制備成DiI標(biāo)記的納米粒(DiI/IFNPs)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察IFNPs的大小及分散性；稀釋IFNPs至1 g/L滴于硅片上，干燥過夜后以掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)；將1 g/L的IFNPs置于銅網(wǎng)上，自然干燥成膜，以透射電子顯微鏡觀察IFNPs的表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)；采用馬爾文粒徑分析儀測量IFNPs大小、分布及電位。

1.4IR780包封率測定 取4 mg IR780溶于二氯甲烷中，配成0.4 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成不同濃度后，以紫外分光光度計測量其吸光值，取最大吸收峰處的吸光度值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；經(jīng)低溫離心后取IFNPs上清液，以紫外分光光度計測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出上清液中IR780含量，計算包封率，包封率=(IR780投入量-上清液中IR780含量)/IR780投入量×100%。

1.5體外超聲成像 制備IFNPs，配制成濃度為2.5、5.0、10.0、20.0 g/L的溶液(實(shí)驗(yàn)組)，各取200 μl置于96孔板內(nèi)，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline， PBS)為對照組，用波長為808 nm能量為2 W/cm2的激光輻照5 min后取出，置于瓊脂糖凝膠模型中，觀察其B模式及造影模式二維灰階超聲圖像。

1.6體外光聲成像 制備IFNPs，配制成濃度為2.5、5.0、10.0、20.0 g/L的溶液(實(shí)驗(yàn)組)，各取200 μl置于瓊脂糖凝膠模型中，以PBS為對照組，于激光激發(fā)下采用光聲成像儀(波長700 nm，重復(fù)頻率10 Hz，脈沖寬度5 ns，超聲探頭頻率10 MHz)進(jìn)行光聲信號及二維圖像采集。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件。首先對計量資料數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布以±s表示，采用單因素方差分析比較不同濃度IFNPs各實(shí)驗(yàn)組及對照組光聲信號值，兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IFNPs一般性質(zhì) 制備所得IFNPs外觀為綠色混懸液，光學(xué)顯微鏡下形態(tài)規(guī)則，大小均一(圖1A)；激光共聚焦顯微鏡下DiI標(biāo)記的IFNPs粒徑均一，分散性好(圖1B)；透射電子顯微鏡下表現(xiàn)為外殼黑色、內(nèi)部灰白色的球形結(jié)構(gòu)(圖1C)；掃描電子顯微鏡由于電壓較高，IFNPs部分發(fā)生相變，殘留下來的納米粒呈球形，表面光滑(圖1D)；馬爾文粒徑分析檢測IFNPs的大小為(241.87±3.47)nm(圖1E)，電位為(-0.766±0.096)mV。

2.2IR780的包封率 IR780在波長為780 nm處出現(xiàn)最大吸收峰(圖2)，將波長設(shè)定在780 nm，選擇吸光度為0.2～0.8的點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出IR780的包封率為(90.38±0.48)%。

2.3體外超聲成像表現(xiàn) 隨IFNPs濃度增加，B模式及造影模式回聲均逐漸增強(qiáng)，對照組PBS的回聲均低于不同濃度IFNPs各實(shí)驗(yàn)組(圖3)。

2.4體外光聲成像表現(xiàn) 光聲成像顯示，隨IFNPs濃度增加，光聲信號逐漸增強(qiáng)(圖4)。濃度為2.5、5.0、10.0、20.0 g/L的IFNPs光聲值分別為0.49±0.02、0.67±0.07、1.05±0.10和1.33±0.05，對照組PBS的光聲值為0.05±0.01，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=95.280，P<0.001)，不同濃度IFNPs各實(shí)驗(yàn)組光聲值均高于對照組(P均<0.05)，且各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

在已有分子影像探針的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用生物相容性的PLGA作為殼膜材料，包裹PFP和IR780，利用雙乳化法制備了可進(jìn)行超聲/光聲雙模態(tài)成像的光致相變納米粒造影劑IFNPs。PLGA是美國FDA認(rèn)證的一類可降解高分子聚合物，生物安全性良好，制備成納米粒之后，由于粒徑較小，比表面積增大，可顯著增加細(xì)胞對其的攝取，同時保證納米粒在體內(nèi)不會對正常組織造成損害。作為一種近紅外染料，IFNPs內(nèi)部的IR780化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含1個剛性的聚乙烯基環(huán)，中間有1個氯原子，有強(qiáng)烈的疏水性，由于其對有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporting polypeptides， OATPs)的親和力，使IR780在腫瘤區(qū)域大量積聚，對腫瘤的診療有巨大優(yōu)勢[8,10-11]；將其包載進(jìn)IFNPs后可增加水溶性，進(jìn)一步促進(jìn)其在體內(nèi)發(fā)揮作用。有研究[12]將IR780包裹在人血清白蛋白內(nèi)形成納米粒，用于對腫瘤進(jìn)行光熱及光動力治療，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)此種納米粒既可產(chǎn)生過高熱又可產(chǎn)生活性氧，能夠顯著抑制小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞的生長。少量的IR780安全性很高，在1～2天內(nèi)即可自循環(huán)系統(tǒng)中完全清除，而不被肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬[13]。作為IFNPs內(nèi)核的液態(tài)PFP在常溫下為液態(tài)，受激光觸發(fā)后變?yōu)闅鈶B(tài)，逐漸膨脹直至納米粒破裂，無需生物降解。因此，將IR780和PFP包裹進(jìn)PLGA內(nèi)制備成的納米粒生物安全性極高，且所制備的IFNPs在常溫下可放置1周、4℃下可放置1個月，穩(wěn)定性好，有望作為一種雙模態(tài)造影劑應(yīng)用于臨床。

圖1 IFNPs一般性質(zhì) A.光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)(×400)； B.激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)(×400)； C.透射電子顯微鏡下表現(xiàn)(×20 000)； D.掃描電子顯微鏡下表現(xiàn)(×5 000)； E.粒徑分布圖 圖2 IR780紫外可見光吸收光譜圖

圖3 對照組(PBS)及不同濃度(2.5、5.0、10.0、20.0 g/L)IFNPs各實(shí)驗(yàn)組B模式(A～E)及造影模式(F～J)聲像圖

圖4 對照組(PBS，A)及不同濃度(2.5、5.0、10.0、20.0 g/L)IFNPs各實(shí)驗(yàn)組(B～E)體外光聲成像圖

本研究對IFNPs進(jìn)行物理性質(zhì)檢測，發(fā)現(xiàn)納米粒呈綠色，顏色均勻，未見游離相。IFNPs在光學(xué)顯微鏡、共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡下呈球形，外表光滑，大小均一，粒徑較小，且分散性好；透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)外殼黑色而中間灰白色的球形結(jié)構(gòu)，這是由于IR780與PFP的電子密度不同所致。IFNPs的粒徑為(241.87±3.47)nm。一項有關(guān)嚙齒類動物的研究[14]表明，腫瘤微血管孔徑為100～780 nm，而大部分正常組織(腎臟、肝臟和脾臟除外)微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接空隙<2 nm。本實(shí)驗(yàn)制備的納米粒能夠通過腫瘤微血管進(jìn)入腫瘤，而不易進(jìn)入正常組織間隙。體外二維灰階超聲成像顯示，隨納米粒濃度增加，B模式和造影模式下的回聲均逐漸增強(qiáng)，而對照組未顯影，表明IFNPs成功包載了PFP。在808 nm波長的激光輻照下，IR780良好的光熱性能使其內(nèi)部包裹的PFP發(fā)生液氣相變，從而增強(qiáng)了B模式和造影模式下的成像效果。納米粒在780 nm處有強(qiáng)烈的吸收峰，且IR780的包封率非常高，因此在近紅外激光的觸發(fā)下，隨IFNPs濃度增加，光聲信號逐漸增強(qiáng)，而對照組未顯影，進(jìn)一步證實(shí)了IR780被成功包裹進(jìn)入IFNPs。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過雙乳化法成功制備了包裹IR780的液態(tài)氟碳納米粒IFNPs，且其形態(tài)規(guī)則，大小均一，分散性好，在體外瓊脂糖凝膠模型中對超聲/光聲雙模態(tài)顯影效果均非常明顯，表明此納米粒具有超聲/光聲雙模態(tài)成像的效果。本研究的主要局限性在于IFNPs未連接可主動靶向至腫瘤的配體，只能通過被動靶向(增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng))聚集到腫瘤。未來在用于體內(nèi)時，應(yīng)將IFNPs與特異性靶向配體連接，以提高納米粒主動靶向到腫瘤的能力，以期實(shí)現(xiàn)對腫瘤的可視化治療。