用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定經(jīng)澄清劑精制后一貫煎中多糖含量的可行性分析

白 蘭，鄭 宇

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075）

一貫煎[1]是清朝魏之琇發(fā)明的滋陰疏肝名方。該方是治療陰虛肝郁、肝胃不和所致脘脅疼痛的常用藥方?，F(xiàn)代中醫(yī)常用一貫煎治療慢性肝炎、慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、肋間神經(jīng)痛、神經(jīng)官能癥等。研究發(fā)現(xiàn)，一貫煎處方中的生地黃、枸杞、北沙參、當(dāng)歸、麥冬均含有多糖成分[2]，且一貫煎的臨床藥理作用與其所含的多糖成分有關(guān)[3，4]。因此，對(duì)一貫煎中多糖的含量進(jìn)行測(cè)定具有重要的臨床意義。本次研究主要探討用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定經(jīng)澄清劑精制后一貫煎中多糖含量的可行性。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

本次實(shí)驗(yàn)使用的儀器是UV1700型紫外分光光度儀（日本島津公司生產(chǎn)）、BP 211D 型十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)Sartorius 公司生產(chǎn))、超聲清洗器、水浴鍋及制冰機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

本次實(shí)驗(yàn)使用的試劑是D-無(wú)水葡萄糖（中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：110833-201205）及苯酚、硫酸。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備一貫煎樣品溶液的方法

按照一貫煎的處方稱(chēng)取藥材，加10倍的清水煎煮2次，每次煎煮1.5 h，對(duì)所得藥液進(jìn)行濾過(guò)處理。將兩次煎煮所得的藥液合并在一起，制作成濃縮液以備用（藥材與藥液體積的比值為1:1）。將濃縮液按照1:8的比例稀釋后，放到溫度為80℃的恒溫水浴中進(jìn)行攪拌。將稀釋后的濃縮液平均分為A組和B組。在A組濃縮液中加入濃度為2%的ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型。120 min后，在B組濃縮藥液中加入濃度為4%的ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型。對(duì)兩組稀釋后的濃縮液持續(xù)攪拌30 min后，將其放到溫度為4℃的環(huán)境中靜置24 h，并進(jìn)行濾過(guò)處理，將濾液濃縮至藥材與藥液體積的比值為1:1時(shí)即得經(jīng)澄清劑精制后的一貫煎樣品溶液。

2.2 制備對(duì)照品溶液的方法

精密稱(chēng)取104.8 g 的D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，將其放到容量為100 ml的量瓶中，用蒸餾水將其稀釋至刻度后搖勻，即得濃度為1.048 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.3 制備供試品溶液的方法

精密量取0.5 ml的一貫煎樣品溶液，將其放到容量為100 ml的量瓶中，用蒸餾水將其稀釋至刻度后搖勻。再精密量取0.1 ml的一貫煎樣品溶液，將其放到容量為25 ml的刻度試管中，按照2.1中的方法進(jìn)行操作，即得供試品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

分 別 精 密 量 取 0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml的對(duì)照品溶液，將其分別置于容量為25 ml的刻度試管中，并分別加入適量的蒸餾水，使其達(dá)到2.0 ml。然后在刻度試管中分別加入6 ml的蒽酮試液（用濃度為80%的硫酸將0.1 g的蒽酮稀釋至100 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配）。將刻度試管放到渦旋振蕩機(jī)中處理。然后將刻度試管放到沸水浴中加熱15 min。取出刻度試管后，立即將其置于冰水浴中冷卻15 min。使用同樣的方法將2 ml的蒸餾水制作成空白對(duì)照溶液。將這兩種溶液放到UV1700型紫外分光光度儀中進(jìn)行紫外分光掃描，進(jìn)行紫外分光掃描的波長(zhǎng)為627 nm，以測(cè)定這兩種溶液的吸光度。將吸光度(Y)作為縱坐標(biāo)，將D-無(wú)水葡萄糖的濃度(X)作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為Y=1.669X-0.1431（r=0.9989）。結(jié)果表明，D-無(wú)水葡萄糖的測(cè)定量在0.2096～1.2576 mg／L范圍內(nèi)時(shí)的線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.2 進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

將對(duì)照品溶液和供試品溶液放到UV1700型紫外分光光度儀中進(jìn)行紫外分光掃描。進(jìn)行紫外分光掃描的波長(zhǎng)為500～700 nm。結(jié)果顯示，在進(jìn)行紫外分光掃描的波長(zhǎng)為627 nm時(shí)有最大的吸收波長(zhǎng)且無(wú)干擾。詳情見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品溶液（左）與供試品溶液（右）的波長(zhǎng)掃描圖

3.3 進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

取0.4 ml的對(duì)照品溶液，對(duì)其進(jìn)行6次吸光度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液的平均吸光度為0.447，其RSD=0.38%。說(shuō)明該測(cè)定法的精密度良好。

3.4 進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

取同一批次的6份樣品，按照2.3中的方法制備供試品溶液，對(duì)供試品溶液進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，供試品溶液中多糖的平均含量為0.7786 g/ml，其RSD=1.9%，說(shuō)明此法的重復(fù)性良好。

3.5 進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果

取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的1份供試品溶液，在同一條件下，分別在第0 min、第10 min、第20 min、第30 min、第40 min、第60 min時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，記錄并計(jì)算供試品溶液的峰面積。結(jié)果顯示，供試品溶液的RSD=0.8%。說(shuō)明供試品溶液在常溫條件下放置60 min的穩(wěn)定性較好。

3.6 進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

精密量取同一批次6份0.05 ml的一貫煎樣品溶液，將這些樣品溶液分為三組，分別加入0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml的對(duì)照品溶液。按照2.3中的方法制備供試品溶液。對(duì)所得的供試品溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，三組供試品溶液的平均回收率為97.50%、99.52%、99.47%。詳情見(jiàn)表1。

表1 對(duì)一貫煎樣品溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

3.7 進(jìn)行多糖含量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

精密量取三批一貫煎樣品溶液各0.5 ml，按照2.3中的方法制備供試品溶液，測(cè)定這三批供試品溶液中多糖的含量。結(jié)果顯示，這三批供試品溶液中多糖的含量分別為0.897 g/ml、0.815 g/ml、0.933 g/ml。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，采用蒽酮-硫酸比色法基本可以測(cè)定中藥復(fù)方制劑中所有碳水化合物及寡糖類(lèi)、多糖類(lèi)的含量[5]。中藥復(fù)方制劑中的有效成分較多且結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，導(dǎo)致難以對(duì)其中的多糖成分進(jìn)行定量檢測(cè)。對(duì)中藥復(fù)方制劑中的多糖成分進(jìn)行定量檢測(cè)，需建立在提取、分離純化、純度分析、組分分析等一系列前期工作的基礎(chǔ)上。目前，靈芝、香菇、石斛等中藥中的多糖已經(jīng)可以通過(guò)分離、精制、純化等操作進(jìn)行處理，常用的定量檢測(cè)方法是蒽酮-硫酸比色法。筆者相信，隨著我國(guó)中藥成分提取技術(shù)及分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，該方法的臨床應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。