血漿miR?1183在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

劉學(xué)娟 徐遠(yuǎn)東 祝梓原 吳小兵 黎淑玲 甘海寧 徐學(xué)虎

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科（廣州 510150）；2廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科（廣州 510080）

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年有約70萬(wàn)人因結(jié)直腸癌致死［1］。中國(guó)最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)指出：我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在男性中分別居第四和第五位，在女性中分別居第三位和第四位［2］。在臨床上超過(guò)50%的患者在初診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了局部轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失最佳診治時(shí)機(jī)而預(yù)后不良。因此，探尋有效的結(jié)直腸癌早期診斷或預(yù)后監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記物，對(duì)改善患者預(yù)后，提高患者生存率具有重要的意義。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長(zhǎng)約18～25 nt的非編碼單鏈小RNA。循環(huán)中的miRNA特異性和穩(wěn)定性較好，被證實(shí)在多種腫瘤的診斷、篩查、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷中具有重要作用［3-5］。miR?1183定位于7號(hào)染色體，其參與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）促血管生成功能［6］。在風(fēng)濕性心臟病繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓疾病中具有診斷標(biāo)記物的潛能［7］。干擾miR?1183與EPCAM基因的功能多態(tài)性結(jié)合和子宮頸癌、乳腺癌的發(fā)生進(jìn)展相關(guān)［8-9］。DELLA 等［10］發(fā)現(xiàn) miR?1183，miR?483?5p等13個(gè)標(biāo)記物聯(lián)合可作為晚期直腸癌患者化療療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。然而miR?1183在結(jié)直腸癌中的具體作用尚不清楚。

本研究旨在通過(guò)檢測(cè)各期結(jié)直腸癌患者、上皮內(nèi)瘤變者和健康體檢者血漿中miR?1183的表達(dá)水平，分析其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，初步探討血漿miR?1183在結(jié)直腸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1病例資料采集2011年1月至2017年5月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科診治的68例結(jié)直腸癌患者來(lái)源的16例癌與癌旁組織樣本和68例術(shù)前外周血樣本。其中男39例，女29例，年齡范圍37～88歲，中位年齡為65歲；0期1例，Ⅰ期7例，Ⅱ期26例，Ⅲ期25例，Ⅳ期9例。納入者均為初發(fā)未治，病理診斷為結(jié)直腸癌不伴有其他腫瘤或重大疾病。15例上皮內(nèi)瘤變者和25例健康者外周血分別采集于內(nèi)鏡中心和體檢中心。從患者手術(shù)日開始定期電話隨訪，截止日期是2018年3月21日，隨訪時(shí)間為10～86個(gè)月；至隨訪結(jié)束，33例死亡，30例存活，5例失訪。本研究獲得廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，樣本提供者均簽署知情同意。

1.2組織和血漿樣本的采集癌和癌旁組織（距腫瘤5 cm以上）樣本采集后立即放于液氮中保存過(guò)夜，再保存于-80℃冰箱。EDTA抗凝管采集外周靜脈血4 mL，4℃離心機(jī)以3 500 r/min離心10 min，收集上清液至凍存管，置-80℃條件下儲(chǔ)存。

1.3總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)組織樣本用Life公司的TRIzol試劑抽提組織總RNA，NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量，當(dāng)D260/D280為1.8～2.0即可認(rèn)為已達(dá)標(biāo)。再取2 μL總RNA為模板，用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后根據(jù)Takara的PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。血漿樣本用miRNeasy Serum/Plasma Kit血漿提取試劑盒提取血漿總RNA，當(dāng)D260/D280為1.6～1.8，認(rèn)為RNA質(zhì)量達(dá)到要求。取2 μL總RNA作為模板，按照miScript ll RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)，再按照miScript SYBR Green PCR Kit進(jìn)行擴(kuò)增（血漿樣本所用試劑盒均購(gòu)自qiagen）。

miR?1183的引物序列：正向引物為5′?CACTG?TAGGTGATGGTGAGAGTGGCA?3′，反向引物為 5′?CTCAACTGGTGTCGTGGA?3′；組織以U6為內(nèi)參，正向引物為 5′?CTCGCTTCGGCAGCACA?3′，反向引物為5′?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3′，血漿用miR?39?1（Spike?In Control購(gòu)自 qiagen）作為外參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3復(fù)孔，采集Ct值，miR?1183的相對(duì)表達(dá)量用 2-ΔCt法表示，ΔCt=Ct miR?1183?Ct U6/Ct miR?39?1。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用x±s表示；血漿miR?1183的數(shù)據(jù)偏態(tài)分布或方差不齊時(shí)，以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。癌與癌旁組織差異用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，血漿樣本兩組間比較及臨床病理參數(shù)相關(guān)分析采用Mann?Whitney U檢驗(yàn)，3組間比較采用Kruskal?Wallis檢驗(yàn)。用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析血漿miR?1183對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能。Kaplan?Meier法繪制生存曲線，并進(jìn)行Log?rank檢驗(yàn)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織樣本中miR?1183的表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)16組配對(duì)的結(jié)直腸癌組織樣本，發(fā)現(xiàn)癌組織中miR?1183的表達(dá)水平高于癌旁正常組織（t=3.626，P=0.002 5）（圖 1A）。

2.2結(jié)直腸癌患者、上皮內(nèi)瘤變者和健康對(duì)照者血漿樣本中miR?1183的表達(dá)水平對(duì)25例健康者、15例上皮內(nèi)瘤變者和68例結(jié)直腸癌患者的血漿miR?1183水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。Kruskal?Wallis檢驗(yàn)分析3組之間血漿 miR?1183的表達(dá)差異，結(jié)果表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。Mann?Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果顯示，血漿miR?1183的表達(dá)水平在腫瘤組高于健康對(duì)照組（P＜0.000 1），上皮內(nèi)瘤變組也高于健康對(duì)照組（P=0.000 3），并且結(jié)直腸癌組高于上皮內(nèi)瘤變組（P=0.000 7）（圖 1B）。

圖1 qRT?PCR檢測(cè)miR?1183在結(jié)直腸癌組織和血漿中的表達(dá)水平Fig.1 Detection the expression of miR?1183 in colorectal cancer tissues and plasma by qRT?PCR

2.3血漿miR?1183表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Mann?Whitney U檢驗(yàn)分析68例結(jié)直腸癌患者血漿中miR?1183的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者血漿miR?1183高表達(dá)與患者的臨床分期（P=0.001 7）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001 9）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.039 1）、CEA表達(dá)（P=0.041 1）顯著相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤位置和分化程度無(wú)顯著相關(guān)（表1）。

表1 miR?1183在結(jié)直腸癌血漿中表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between expression of miR?1183 and clinicopathological parameters

2.4 ROC曲線分析血漿miR?1183對(duì)結(jié)直腸癌和上皮內(nèi)瘤變的診斷潛能ROC曲線分析顯示，血漿miR?1183水平鑒別結(jié)直腸癌患者和健康人的AUC為0.89，95%CI為0.823 1～0.956 9（P＜ 0.000 1），靈敏度為83.82%，特異度為100%，截?cái)嘀禐?.057 15；血漿miR?1183水平鑒別上皮內(nèi)瘤變患者和健康人的AUC為0.845 3，95%CI為0.713 4～ 0.977 3（P=0.000 3），靈敏度為66.67%，特異度為100%，截?cái)嘀禐?.053 55（圖2）。

圖2 ROC曲線分析血漿miR?1183對(duì)結(jié)直腸癌和上皮內(nèi)瘤變的診斷潛能Fig.2 ROC curve analysis of the diagnostic potential of plasma miR?1183 on colorectal cancer and intraepithelial neoplasia

2.5 血漿miR?1183表達(dá)與生存期的關(guān)系Kaplan?Meier法生存分析顯示，血漿miR?1183高表達(dá)患者的總生存期明顯短于低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。進(jìn)一步單因素及多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響結(jié)直腸癌患者總生存的因素，發(fā)現(xiàn)臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和血漿miR?1183的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的總生存相關(guān)，可作為結(jié)直腸癌患者總生存的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因子（均P＜ 0.05）（表2）。

圖3 血漿miR?1183表達(dá)與生存期的關(guān)系Fig.3 Correlation of plasma miR?1183 expression with survival

表2 影響結(jié)直腸癌患者總生存期的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivarable analyses of actors predictive of poor overall survival in colorectal cancer patients

3 討論

結(jié)直腸癌的5年生存率在局部侵犯者中可達(dá)90%，區(qū)域浸潤(rùn)者中降至68%，伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者已不足10%［11-12］，提示結(jié)直腸癌治療的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)，特別在瘤變階段得到及時(shí)診治是提高患者生存預(yù)后最有效途徑［13］。做到對(duì)結(jié)直腸癌高危人群的早發(fā)現(xiàn)，及時(shí)干預(yù)，臨床上尚缺乏更為精準(zhǔn)的預(yù)警手段或生物指標(biāo)。

循環(huán)miRNA在多種腫瘤中被證實(shí)可以輔助腫瘤早期診斷、療效評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)及預(yù)后檢測(cè)等，有望轉(zhuǎn)化為敏感而特異的腫瘤標(biāo)記物［14-15］。miR?1183在宮頸癌、乳腺癌和晚期直腸癌中差異表達(dá)，間接參與腫瘤的進(jìn)展，其在腫瘤包括結(jié)直腸癌中的具體作用仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)miR?1183在結(jié)直腸癌組織和血漿中高表達(dá)，并且血漿miR?1183表達(dá)量在健康-瘤變-癌的演變過(guò)程中有梯度上調(diào)趨勢(shì)；血漿miR?1183表達(dá)量與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、CEA表達(dá)顯著相關(guān)；提示血漿miR?1183具有作為結(jié)直腸癌診斷和分期標(biāo)記物的潛能。ROC曲線分析顯示血漿miR?1183從健康人中篩選上皮內(nèi)瘤變和結(jié)直腸癌患者的價(jià)值高，AUC分別為0.845 3和0.89。生存分析顯示結(jié)直腸癌血漿miR?1183高表達(dá)與生存期短顯著相關(guān)，不僅證明其在結(jié)直腸癌中具有較高輔助診斷效能，還證實(shí)其是一個(gè)預(yù)后預(yù)測(cè)的獨(dú)立影響因素。綜上，miR?1183高表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為結(jié)直腸癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的新型標(biāo)記物。

本研究納入樣本類型豐富，有完整的病理及隨訪資料，不僅考慮到miR?1183在組織和血漿中表達(dá)的相關(guān)性［16］，更能系統(tǒng)探究miR?1183在結(jié)直腸癌中的臨床價(jià)值，為課題組進(jìn)一步大樣本分析其與分期關(guān)系，確定閾值范圍奠定基礎(chǔ)。本研究的局限在于納入的患者有限，未能排除個(gè)體特征差異對(duì)結(jié)果可能產(chǎn)生的影響［17］。另外，miR?1183參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的功能機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，miR?1183具有作為結(jié)直腸癌輔助診斷及預(yù)后判斷標(biāo)記物的潛能。然而，miR?1183作為分子指標(biāo)應(yīng)用于臨床，尚需更加深入的研究，本課題組將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，探討其在結(jié)直腸癌中可能涉及的功能機(jī)制，及其聯(lián)合其他miRNA或血清腫瘤標(biāo)志物預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的潛能。