尿可溶性CD163在慢性移植腎腎損傷中的作用

楊迷玲 徐憲偉 張果 曲青山 楊金花

鄭州人民醫(yī)院1病理科，2器官移植科（鄭州450003）

腎移植是腎功能衰竭患者的有效治療手段。隨著外科技術(shù)的發(fā)展和新型免疫抑制劑的發(fā)現(xiàn)，腎移植受者的短期存活率顯著提高，但移植腎的長期存活狀況并沒有明顯改善［1］。慢性移植腎腎損傷（chronic kidney allograft injury，CAI）是影響移植腎長期存活的主要因素。主要表現(xiàn)為移植腎功能進(jìn)行性減退，最終可導(dǎo)致腎功能衰竭。預(yù)防CAI是提高移植腎存活率的主要目標(biāo)之一。然而，CAI的發(fā)生原因和機(jī)制尚不清楚，CAI缺乏早期診斷的生物標(biāo)志物。因此，本研究用ELISA法和免疫組化法分別檢測尿可溶性CD163水平和移植腎組織中CD163和SMA的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析尿可溶性CD163水平和CD163標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞與移植腎間質(zhì)纖維化和患者腎功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源選取鄭州人民醫(yī)院病理科2014年至2017年病理診斷為慢性移植腎腎損傷的石蠟標(biāo)本30例，其中男18例，女12例，年齡18～53歲。按Banff 2017年移植腎活檢診斷標(biāo)準(zhǔn)慢性移植腎腎損傷間質(zhì)纖維化分3級：Ⅰ級12例，Ⅱ級10例，Ⅲ級8例，用Masson三色染色評估間質(zhì)纖維化來選取標(biāo)本；同時(shí)選取10例正常腎組織作為對照，在選取標(biāo)本時(shí)已除外其他已知原因引起的間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮，只選取非特定致病因素引起的間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮，不伴有腎小管炎和動(dòng)脈內(nèi)膜炎；在做腎穿刺的當(dāng)天留取晨尿10 mL，置于尿管中，以2 000 r/min離心10 min，然后吸取上層尿液分裝于1.5 mL離心管中并作好標(biāo)記，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑鼠抗人單克隆抗體CD163（克隆號10D6），鼠抗人單克隆抗體SMA（克隆號1A4）購自福州邁新公司；人sCD163ELISA試劑盒購自美國RD公司。

1.3方法

1.3.1ELISA實(shí)驗(yàn)開始前從冰箱取出試劑盒，平衡至室溫，按照試劑盒說明書配制所需要的稀釋液和洗滌液，并提前將凍存的尿液標(biāo)本從-80℃冰箱中取出，冰上解凍。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2免疫組化所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，然后用免疫組織化學(xué)EliVision法染色。免疫組化操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。預(yù)處理：CD163采用檸檬酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）高溫高壓修復(fù)，SMA無需修復(fù)。經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照。

1.4結(jié)果判定ELISA結(jié)果判讀：用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm波長讀板，獲取吸光值（OD值），每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值后即為最后OD值，然后以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)OD值計(jì)算出樣品sCD163濃度。然后樣品復(fù)孔取平均值。

用Masson三色染色來評估間質(zhì)纖維化程度，在400倍鏡下，每張切片隨機(jī)選取25個(gè)視野，陽性染色面積占整個(gè)區(qū)域的比值即為纖維化的程度［2］。

免疫組化結(jié)果的判讀［3］：CD163標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞，胞漿棕黃色判讀為陽性，在400倍鏡下，每張切片至少連續(xù)計(jì)數(shù)9個(gè)高倍視野，再取其平均值，SMA標(biāo)記活化的肌纖維母細(xì)胞，胞漿棕黃色為陽性。陽性區(qū)域計(jì)算方法：在200倍鏡下，每張切片至少計(jì)數(shù)6個(gè)中倍視野的腎皮質(zhì)區(qū)，避開腎小球和大血管。將所選視野用蔡司顯微鏡進(jìn)行拍照，再將圖片輸入Imagepro plus 6.0圖像處理軟件對圖片進(jìn)行定量檢測。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。均數(shù)用表示，組間比較用方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Masson三色染色評估移植腎間質(zhì)纖維化的程度按Banff 2017年［4］移植腎活檢診斷標(biāo)準(zhǔn)分3級：（1）Ⅰ級：輕度間質(zhì)纖維化，累及范圍＜25%的腎實(shí)質(zhì)；（2）Ⅱ級；中度間質(zhì)纖維化，累及范圍達(dá)到26%～50%的腎實(shí)質(zhì)；（3）Ⅲ級：重度間質(zhì)纖維化，累及范圍＞50%的腎實(shí)質(zhì)。

2.2CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平（表1）sCD163在CAI患者尿液中的表達(dá)水平顯著高于正常人，隨著移植腎間質(zhì)纖維化級別的升高，sCD163表達(dá)水平逐漸增加，患者的血Cr和BUN平均值也逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平Tab.1 Levels of urinary sCD163，serum creatinine and urea nitrogen in patients with CAI and normal subjects ±s

表1 CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平Tab.1 Levels of urinary sCD163，serum creatinine and urea nitrogen in patients with CAI and normal subjects ±s

纖維化程度正常Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級例數(shù)10 12 10 8 sCD163（ng/mL）0.36±0.05 1.53±0.27 3.66±0.85 5.71±1.02血Cr（μmol/L）65.80±3.99 172.75±24.55 266.20±27.99 447.88±48.52 BUN（mmol/L）4.87±0.84 16.78±2.19 28.10±3.07 42.88±4.52

2.3CD163和SMA在移植腎組織和正常腎組織中的表達(dá)（表2和圖1）CD163標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞在移植腎組織間質(zhì)中的數(shù)量顯著高于正常腎組織，并且隨著移植腎間質(zhì)纖維化程度的加重，M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量也增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各級纖維化的移植腎組織中SMA和CD163的相對表達(dá)量Tab.2 Relative expression of SMA and CD163 in kidney allografts ±s

表2 各級纖維化的移植腎組織中SMA和CD163的相對表達(dá)量Tab.2 Relative expression of SMA and CD163 in kidney allografts ±s

纖維化程度正常Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級例數(shù)10 12 10 8 SMA 2.90±1.19 21.00±2.69 39.00±4.69 63.75±9.22 CD163 2.70±2.05 91.50±25.36 263.10±51.25 394.75±124.61

SMA在移植腎組織間質(zhì)中的陽性區(qū)域面積顯著高于正常腎組織，并且隨著移植腎間質(zhì)纖維化級別的升高而增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 移植腎組織中Masson三色染色及免疫組化CD163和SMA的表達(dá)Fig.1 Masson tricolor staining and immunohistochemical expression of CD163 and SMA in kidney allografts

2.4 尿sCD163與移植腎組織中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量和血Cr的相關(guān)性（圖2）隨著移植腎間質(zhì)纖維化級別的升高，尿sCD163水平逐漸增加，M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量也逐漸增多，二者呈正相關(guān)（r=0.847，P ＜0.001）。尿sCD163水平與血Cr水平呈正相關(guān)（r=0.916，P ＜0.001）。

圖2 尿sCD163水平與移植腎組織中CD163+的M2型巨噬細(xì)胞和血清Cr水平的相關(guān)性Fig.2 Correlation between urinary sCD163 levels and CD163 positive M2 macrophages and Serum Cr levels in kidney allografts

2.5 腎組織中CD163+的M2型巨噬細(xì)胞與SMA陽性面積和患者血Cr的相關(guān)性（圖3）隨著移植腎間質(zhì)纖維化級別的升高，SMA陽性區(qū)域面積逐漸增大，M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量也逐漸增多，二者呈正相關(guān)（r=0.963，P ＜0.001）。M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量與血Cr水平呈正相關(guān)（r=0.937，P＜0.001）。

圖3 移植腎組織中CD163+的M2巨噬細(xì)胞與間質(zhì)纖維化程度和血清Cr水平的相關(guān)性Fig.3 Correlation between CD163 positive M2 macrophages and interstitial fibrosis and serum Cr levels in kidney allografts

3 討論

慢性移植腎腎?。–AN）是影響腎移植患者遠(yuǎn)期效果的主要因素。CAN在組織學(xué)上主要表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮，然而這些組織學(xué)表現(xiàn)不具有特異性，在多種移植腎腎病中均可見到，比如免疫抑制劑的藥物毒性、慢性排斥反應(yīng)、病毒感染等。2007年發(fā)表的新班夫分類，摒棄了CAN一詞，代之以更準(zhǔn)確的術(shù)語“間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮，非特定因素所致”，命名為慢性移植腎腎損傷（CAI）［5］。2017 年的班夫分類重新定義了慢性活動(dòng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，強(qiáng)調(diào)了間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮區(qū)的炎癥（i?IFTA）的重要性，中度的i?IFTA伴中或重度的小管炎即可診斷為慢性活動(dòng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，工作組認(rèn)為i?IFTA與移植物的存活率降低有關(guān)［4］。本研究在選取標(biāo)本時(shí)已將已知原因引起的間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮排除在外，并且不伴有小管炎和動(dòng)脈內(nèi)膜炎。

CD163是一種分子量約為130 kD的單鏈跨膜糖蛋白，屬于富含半胱氨酸的清道夫受體超家族，是血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物的清道夫受體，特異性的表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞膜表面，其在體內(nèi)有兩種存在形式：一種是膜結(jié)合型，以跨膜大分子的形式存在于巨噬細(xì)胞膜上；而另一種是可溶性CD163，存在于血漿或其它組織液內(nèi)。CD163是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，在一定的炎癥刺激下，通過金屬蛋白酶的水解作用從胞膜上脫落，并擴(kuò)散到炎癥組織或以其可溶形式進(jìn)入循環(huán)，發(fā)揮抗炎作用［6-8］。

CAI的發(fā)病機(jī)制還不清楚。巨噬細(xì)胞在多種腎疾病中聚集是一種普遍現(xiàn)象，包括炎癥性、非炎癥性腎疾病和移植腎損傷。巨噬細(xì)胞可以被極化成兩種不同的表型，即M1和M2。M1型巨噬細(xì)胞具有促炎表型，常與組織損傷有關(guān)，而M2型巨噬細(xì)胞則是替代途徑活化的巨噬細(xì)胞，被認(rèn)為是抗炎表型，常與組織修復(fù)有關(guān)［9-10］。研究表明CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞與多種腎臟疾病的慢性損傷有關(guān)，比如在糖尿病腎?。―N）中，腎間質(zhì)浸潤的M2型巨噬細(xì)胞與腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、DN分級和腎功能損傷有關(guān)［11］。有研究用小鼠單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型來研究巨噬細(xì)胞與腎纖維化的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)腎損傷后募集的巨噬細(xì)胞極化為M2型，M2型巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)腎纖維化。消除M2型巨噬細(xì)胞可特異性地抑制腎纖維化，而消除M1型巨噬細(xì)胞則無此作用［2］。本研究結(jié)果顯示CD163標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞在移植腎組織間質(zhì)中的數(shù)量顯著高于正常腎組織，并且隨著移植腎間質(zhì)纖維化程度的加重，M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量也逐漸增多，與前述研究結(jié)果一致。有研究通過小鼠腎移植模型研究顯示骨髓源性的M2型巨噬細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)小鼠移植腎纖維化［12］。SMA是肌成纖維細(xì)胞特異的標(biāo)志蛋白，在腎損傷發(fā)生時(shí)，大量生長因子和細(xì)胞因子相互作用，促使肌成纖維細(xì)胞大量增殖、活化。急劇增加的肌成纖維細(xì)胞致使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成增加，增加的ECM沉積于腎間質(zhì)，正常腎組織結(jié)構(gòu)被破壞、腎功能受損，最終發(fā)生間質(zhì)纖維化［13］。本研究發(fā)現(xiàn)SMA在移植腎組織中的陽性面積顯著高于正常腎組織，而且隨著移植腎間質(zhì)纖維化級別的升高而增大，SMA陽性面積與M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量具有顯著的一致性，并且M2型巨噬細(xì)胞主要位于間質(zhì)纖維化區(qū)域。進(jìn)一步分析顯示患者血清Cr的平均值與M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量具有顯著的相關(guān)性，隨著移植腎組織間質(zhì)纖維化程度的加重而升高，這表明M2型巨噬細(xì)胞聚集可以促進(jìn)移植腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，引起移植腎功能不全。

有研究認(rèn)為尿sCD163水平與活動(dòng)性腎血管炎密切相關(guān)，尿sCD163是診斷活動(dòng)性腎血管炎明顯優(yōu)于尿蛋白排泄率的生物標(biāo)志物［14］。還有研究認(rèn)為sCD163可能在漢灘病毒感染后急性腎功能衰竭的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［15］。本研究通過ELISA法檢測了CAI患者尿sCD163水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAI患者尿sCD163水平顯著高于正常人，并且隨著移植腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，尿sCD163水平逐漸升高。相關(guān)性分析顯示尿sCD163水平與移植腎活檢組織中CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，隨著患者血Cr和尿素氮水平的升高，尿sCD163水平和移植腎組織中CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量也逐漸升高，這說明尿sCD163水平可作為CAI患者M(jìn)2型巨噬細(xì)胞依賴性的生物標(biāo)志物。這與ENDO等［16］的研究結(jié)果一致，認(rèn)為狼瘡性腎炎患者腎小球中浸潤的細(xì)胞主要是CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞，尿sCD163水平與CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，且與狼瘡性腎炎的活動(dòng)度相關(guān)。

以往關(guān)于M2型巨噬細(xì)胞在腎損傷中的作用多集中在原發(fā)腎疾病或移植腎動(dòng)物模型上，在國內(nèi)罕見關(guān)于尿sCD163水平在CAI中的研究。本研究初步探討了尿sCD163和CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞在CAI中的作用，結(jié)果顯示CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)移植腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，引起腎移植患者的腎功能不全，最終導(dǎo)致腎功能衰竭，尿sCD163水平可作為CAI患者M(jìn)2型巨噬細(xì)胞依賴性的生物標(biāo)志物。因此，筆者推測在臨床腎移植工作中可以定期檢測患者尿液中sCD163水平來預(yù)測腎移植患者間質(zhì)纖維化發(fā)生的可能性，對臨床防止移植腎纖維化有著重要意義。