活化素B促進(jìn)皮膚傷口部位血管的再生

武薇 曾惠昆 張敏 張琳

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室（廣州 510515）

皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)在時(shí)空上均受修復(fù)因子調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，多種生物活性物質(zhì)在創(chuàng)傷愈合的不同階段發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［1］。其中組織修復(fù)階段形成的肉芽組織在皮膚傷口愈合過(guò)程中具有重要的作用，其形成可以填充傷口，機(jī)化異物，促進(jìn)傷口再上皮化等。而在傷口愈合的早期，肉芽組織中血管新生的多寡及質(zhì)量是影響創(chuàng)面愈合效率和疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［2］。血管再生的調(diào)控是調(diào)節(jié)創(chuàng)傷愈合速度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前已證實(shí)促進(jìn)創(chuàng)傷部位血管形成的生長(zhǎng)因子有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor?β，TGF?β）等［3-4］。目前已有研究表明TGF?β對(duì)血管再生起著重要的調(diào)控作用。在血管再生模型中，根據(jù)TGF?β1含量的不同，它起著復(fù)雜的抑制或刺激作用。外源性TGF?β1刺激微血管向內(nèi)生長(zhǎng)和分化，在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，新生血管形成肉芽組織中見(jiàn)有內(nèi)源性TGF?β1表達(dá)［5］。那么作為TGF?β超家族成員之一的活化素B（Activin B）［6］，對(duì)血管的新生有何作用，目前尚不清楚。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Activin B在活體水平促進(jìn)傷口周圍角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖遷移，提高皮膚創(chuàng)傷愈合率，促進(jìn)傷口的再上皮化［7］。但是Activin B對(duì)傷口愈合過(guò)程中其他生物學(xué)事件有何作用尚不清楚，本研究將探討Activin B在活體水平對(duì)小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合中血管再生的影響，采用小鼠全層皮膚切除模型，觀察Activin B對(duì)創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中肉芽組織增生的情況以及血管的再生，為細(xì)胞因子Activin B的治療應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠20只，6～8周，雌性，體質(zhì)量20～25 g，由自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)。

1.2儀器設(shè)備和試劑細(xì)胞因子Activin B購(gòu)自R&D公司。CD31購(gòu)自Abcam公司，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α?SMA）、Sabc二抗試劑盒（生物素化羊抗小鼠IgG、鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物）和3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購(gòu)置武漢博士德公司。石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)和烤片機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Leica，Leica正置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica，皮膚微循環(huán)檢測(cè)儀（深圳市生強(qiáng)科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1小鼠皮膚創(chuàng)傷模型的制備20只C57BL/6小鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，小鼠背部?jī)蓚?cè)剪毛后用蜂蜜脫毛凍蠟脫毛，碘酒酒精常規(guī)消毒，在小鼠脊柱兩側(cè)采用直徑8 mm的打孔器各制備1個(gè)圓形全層皮膚缺損模型。術(shù)后動(dòng)物自由進(jìn)食、水。

1.3.2給藥每只C57BL/6小鼠左邊為Activin B組，在創(chuàng)口四周皮下注射Activin B（10 ng/mL），每次0.2 mL，每天2次。右邊為PBS組，在創(chuàng)口四周皮下注射pH值7.4的無(wú)菌PBS，每次0.2 mL，每天2次。單只分籠飼養(yǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間創(chuàng)口均為自然暴露狀態(tài)。

1.3.3創(chuàng)面愈合檢測(cè)每天觀察傷口愈合情況，并使用數(shù)碼相機(jī)記錄第0、3、5、7天傷口部位愈合情況，IPP圖像分析系統(tǒng)計(jì)算創(chuàng)面愈合率，愈合率=（原始創(chuàng)面面積－未愈合的創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.4創(chuàng)面血管觀察分別于傷后第3、5、7天斷髓處死小鼠，將創(chuàng)面及創(chuàng)面周圍1 cm皮膚從深筋膜下方掀起并取下，用手電作光源，進(jìn)行創(chuàng)面透光試驗(yàn)，觀察血管情況并拍攝記錄。

1.3.5組織學(xué)檢查及免疫組化分析于傷后第3、5、7天斷髓處死小鼠，對(duì)創(chuàng)口及創(chuàng)口周圍1 cm皮膚取材，用4%的多聚甲醛液固定，石蠟包埋，切片。HE染色檢測(cè)中，將石蠟切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，蘇木素染核，流水沖洗，自來(lái)水泛藍(lán)，用伊紅染胞質(zhì)，酒精梯度脫水，最后二甲苯透明后封片，在光學(xué)顯微鏡觀察傷口愈合情況及肉芽組織的生長(zhǎng)及血管再生情況。免疫組化檢測(cè)，石蠟切片二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，置于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0），90℃熱修復(fù)10 min，自然冷卻后流水沖洗。3%雙氧水去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗，山羊血清室溫孵育40 min。4℃孵育一抗過(guò)夜。PBS沖洗，室溫孵育二抗40 min。PBS沖洗后DAB顯色。蘇木素復(fù)染，流水沖洗，自來(lái)水泛藍(lán)，常規(guī)脫水、透明、封片。每組免疫組化結(jié)果選取高倍鏡下5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性組織進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.6血流量分析傷后第3、5、7天，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，之后使用皮膚微循環(huán)檢測(cè)儀分別記錄3只小鼠兩側(cè)傷口（PBS組和Activin B組）中心統(tǒng)一大小區(qū)域的動(dòng)態(tài)血流灌注量，記錄血流灌注量曲線，并記錄動(dòng)態(tài)血流灌注量。每組3只小鼠，每個(gè)傷口部位取1 min內(nèi)的血流量（PF）數(shù)值作為原始數(shù)據(jù)，計(jì)算1 min內(nèi)平均血流量值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)的表達(dá)形式是均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。整體比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，相同時(shí)間點(diǎn)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Activin B促進(jìn)C57BL/6小鼠創(chuàng)面愈合皮膚創(chuàng)傷后第3和5天Activin B組傷口顯著小于PBS組（圖1A），統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Activin B組創(chuàng)面閉合率高于PBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1B）。

圖1 皮膚傷口愈合過(guò)程和傷口愈合率統(tǒng)計(jì)折線圖Fig.1 Time course of wound closureand statistical broken line graph of wound closure rate

2.2Activin B促進(jìn)C57BL/6小鼠創(chuàng)面周圍血管進(jìn)入肉芽組織術(shù)后第3、5及7天大體觀察皮膚傷口周圍血管的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后第3和5天，Activin B組肉芽組織周圍血管數(shù)量明顯多于PBS組（圖2A）。而第7天兩組間的血管數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明小鼠創(chuàng)傷的第7天已經(jīng)進(jìn)入傷口愈合的組織重塑階段，肉芽組織中血管數(shù)量開(kāi)始減少。

圖2 Activin B促進(jìn)小鼠創(chuàng)面周圍血管進(jìn)入肉芽組織Fig.2 Activin B promotes blood vessels around the wound into granulation tissue

2.3Activin B促進(jìn)C57BL/6小鼠創(chuàng)面肉芽組織中血管再生，提高血流量H&E染色發(fā)現(xiàn)術(shù)后3 d Activin B組肉芽組織更成熟，成纖維細(xì)胞更多、新生毛細(xì)血管形成，而PBS組肉芽組織以炎癥細(xì)胞為主。術(shù)后第3和5天，如圖2B中黑色箭頭所示Activin B組肉芽組織內(nèi)部新生的薄壁毛細(xì)血管多于PBS組。免疫組化檢測(cè)周細(xì)胞標(biāo)記物α?SMA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后第3和5天，肉芽組織中周細(xì)胞數(shù)量高于PBS組（圖3A），根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），術(shù)后第7天，兩組間周細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B）。進(jìn)一步檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31（圖4A），結(jié)果也發(fā)現(xiàn)術(shù)后第3和5天，肉芽組織中毛細(xì)血管數(shù)量高于PBS組，術(shù)后第7天，兩組間毛細(xì)血管數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）。利用皮膚微循環(huán)檢測(cè)儀檢測(cè)術(shù)后第3和5天肉芽組織中血流量（圖5），發(fā)現(xiàn)Activin B組（創(chuàng)面平均血流量高于PBS組P＜0.01）（圖5D），而術(shù)后第7天，Activin B組創(chuàng)面平均血流灌注量低于PBS組（P ＜0.01）（圖5C、D），這可能是由于Activin B已經(jīng)完成血管再上皮化，肉芽組織中血管減少。

圖3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)周細(xì)胞標(biāo)物α?SMA和兩組肉芽組織中周細(xì)胞的數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析Fig.3 α?SMA，the marker of pericyte were detected by immunocytochemicaland statistical bar chart of the number of pericyte in two groups′granulation tissue

圖4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31和兩組肉芽組織中新生血管的數(shù)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖Fig.4 CD31，the marker of vascular endothelial cell were detected by immunocytochemicaland statistical bar chart of the number of angiogenesis in two groups′granulation tissue

圖5 皮膚微循環(huán)檢測(cè)儀檢測(cè)同一只小鼠兩組傷口部位肉芽組織中平均血流量和平均血流量統(tǒng)計(jì)柱狀圖Fig.5 The blood flow in two groups′granulation tissue about the one mouse were detected by skin micro?circulation testing equipmentand Statistical bar chart of the mean blood flow

3 討論

創(chuàng)傷愈合是十分復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括早期止血、創(chuàng)面保護(hù)、炎癥控制及多種組織細(xì)胞的增生，新生血管的形成，創(chuàng)緣的爬行收縮等［8］。在傷口愈合的早期階段形成的肉芽組織在皮膚傷口愈合過(guò)程中具有重要的作用，血管的新生質(zhì)量和數(shù)量直接影響創(chuàng)傷部位的愈合效率。雖然目前已有研究證實(shí)部分細(xì)胞因子在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中促進(jìn)血管新生，但是因?yàn)閭谟线^(guò)程的復(fù)雜性，血管再生的問(wèn)題依然是傷口愈合尤其是難愈合性傷口研究的重點(diǎn)。

創(chuàng)面血管新生是指皮膚組織損傷后，在各種因素刺激下（如出血、缺血缺氧和炎性反應(yīng)等），在原有微血管床基礎(chǔ)上血管再生的過(guò)程，其為創(chuàng)傷部位提供氧、營(yíng)養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，因此對(duì)創(chuàng)面愈合起到了重要作用［9］。本研究在小鼠創(chuàng)面局部應(yīng)用Activin B后，創(chuàng)面閉合優(yōu)于PBS組。研究發(fā)現(xiàn)Activin B處理后傷口周圍深入至肉芽組織中的毛細(xì)血管增多，繼而在光鏡水平觀察，發(fā)現(xiàn)Activin B處理后傷口部位肉芽組織較成熟，較多新生血管、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。已有的研究認(rèn)為血管生成首先是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，形成新生血管芽，此后血管芽在血流的沖擊下出現(xiàn)管腔，同時(shí)招募間質(zhì)中的周細(xì)胞貼附于新生血管，完成新生血管的塑型［10］。因此筆者利用血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物CD31免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Activin B組傷口部位肉芽組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對(duì)照組。在調(diào)節(jié)傷口部位血管再生的問(wèn)題中，Activin B與TGF?β1具有類似的作用，但是外源性TGF?β1主要是通過(guò)刺激微血管向內(nèi)生長(zhǎng)和分化發(fā)揮作用，那么Activin B是否通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)血管的新生，這將是未來(lái)可以探討的問(wèn)題。

研究發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞能夠感受血管生成刺激，引導(dǎo)血管芽生，是血管生成的先驅(qū)者［11］。因此檢測(cè)周細(xì)胞的標(biāo)記物α?SMA可以反映血管再生［13］。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中周細(xì)胞可能來(lái)源于成纖維細(xì)胞［14］、內(nèi)皮細(xì)胞以及周圍毛細(xì)血管的周細(xì)胞等［15］。本研究發(fā)現(xiàn)肉芽組織中周細(xì)胞（α?SMA陽(yáng)性）增多，一方面提示Activin B促進(jìn)傷口部位肉芽組織中血管的新生，另一方面也提示Activin B對(duì)血管新生過(guò)程中周細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用。TGF?β信號(hào)通過(guò)ALK5/Smad2/3信號(hào)通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化為周細(xì)胞［16］。PDGF?β及其受體通路在新生血管周細(xì)胞的募集中具有關(guān)鍵作用［17］。那么Activin B對(duì)周細(xì)胞有何作用，通過(guò)何種信號(hào)機(jī)制調(diào)節(jié)周細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)而調(diào)節(jié)血管的新生目前尚不清楚。

創(chuàng)傷愈合的病理情況有不愈合和過(guò)渡愈合兩種形式。不愈合主要是指那些不能正常上皮化的開(kāi)放性創(chuàng)面。由于皮膚組織缺損較大，肉芽生長(zhǎng)緩慢，血管新生及膠原沉積減慢［18］，局部血液供應(yīng)不良或者細(xì)菌感染等原因，導(dǎo)致細(xì)胞增殖不良、細(xì)胞老化或功能減退，因而需要較長(zhǎng)時(shí)間修復(fù)。本研究在活體水平初步探討發(fā)現(xiàn)Activin B促進(jìn)傷口部位肉芽組織的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)傷口部位血管的再生和血流灌注量，從而促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合。但是具體的調(diào)控機(jī)制尚未深入研究，因此下一步的研究計(jì)劃是在細(xì)胞水平研究Activin B對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及周細(xì)胞的功能影響。深入探討Activin B在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的血管再生的作用機(jī)制，將為臨床促進(jìn)難創(chuàng)愈合、糖尿病血管病變等疾病的治療提供新的思路。